畢 峰楊明妍楊碩妍

1.吉林省神經(jīng)精神病醫(yī)院，吉林四平 136000；2.長(zhǎng)春理工大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130022

RNA干擾對(duì)Survivin基因抑制效應(yīng)的測(cè)定

畢 峰1楊明妍1楊碩妍2

1.吉林省神經(jīng)精神病醫(yī)院，吉林四平 136000；2.長(zhǎng)春理工大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130022

目的利用RNAi技術(shù)沉默Survivin基因?qū)ζ湟种菩?yīng)進(jìn)行測(cè)定。方法應(yīng)用RNAi技術(shù)，以SurvivinsiRNA重組質(zhì)粒為載體，通過(guò)RT-PCR和Western-blot法檢測(cè)Survivin基因的表達(dá)。結(jié)果Survivin 基因的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，達(dá)到抑制效果；采用Western blot檢測(cè)Survivin在基因表達(dá)水平上的抑制作用，同樣達(dá)到了抑制效果。結(jié)論利用RNA干擾技術(shù)沉默Survivin基因抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡。表明Survivin基因參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，有望成為基因治療的新靶點(diǎn)。

Survivin基因；抑制效應(yīng)；RNA干擾技術(shù)

Survivin基因是一種凋亡抑制蛋白，表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織及胚胎階段組織，如乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、血液系統(tǒng)腫瘤等。Survivin影響著腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，Survivin基因的以上特點(diǎn)可能為今后的基因治療提供新靶點(diǎn)[1]。

RNAi可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控程序達(dá)到抑制基因的目的，可使mRNA降解。RNAi具有高效性、特異性等特點(diǎn)，適用于基因的分析，從而為臨床基因治療開辟新途徑[2]。

本研究選擇在正常成熟組織中不表達(dá)而在腫瘤組織中高表達(dá)的Survivin基因作為研究對(duì)象，利用RNAi技術(shù)沉默Survivin基因[3-9]。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）DNA Ligation Kit、RT-PCR Kit、核酸內(nèi)切酶 HindⅢ、核酸內(nèi)切酶 BamHⅠ、蛋白質(zhì)Marker、RNA Marker、DNA Marker DL8000均購(gòu)自大連寶生物工程公司；（2）抗人Survivin單克隆抗體購(gòu)自Zymed；（3）兔抗人β-actin多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling；（4）ECL試劑盒購(gòu)自Pharmacia；（5）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購(gòu)自KPL；（6）氯仿、異戊醇、胰蛋白胨、瓊脂、酵母浸出粉、RPMI-1640購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；（7）丙烯酰胺、尿素、過(guò)硫酸胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙酰胺、瓊脂糖、二甲苯蘭FF、溴酚藍(lán)、X-gal、PTG、二甲基甲酰胺購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)（YX-J2）：中國(guó)常州國(guó)華；低溫冷凍高速離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；電泳儀、電泳槽（DYY-Ⅲ2）：北京六一儀器廠；PCR儀（PER kin）：ELMER；電穿孔轉(zhuǎn)染儀：中國(guó)上海；Western-blot蛋白電泳系統(tǒng)：Bio-Rad；倒置顯微鏡：Olympus。

2 方法

2.1 轉(zhuǎn)錄水平Survivin抑制效應(yīng)的測(cè)定

2.1.1 細(xì)胞總RNA的提取與鑒定[10]（1）取轉(zhuǎn)染細(xì)胞1×106，加入1mL RNAiso Reagent，反復(fù)吸打直至裂解液中無(wú)明顯沉淀，室溫放置5min。（2）向裂解液中加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放置5min。（3）12 000rpm 4℃離心15min。樣品分三層：上層的上清液、中間的白色蛋白質(zhì)層及下層的黃色有機(jī)相，RNA主要在上清液內(nèi)。（4）將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒離心管充分混勻，室溫放置10min。（5）12 000rpm 4℃離心10min。離心前看不出RNA沉淀，離心后在離心管側(cè)壁和管底可見(jiàn)膠狀沉淀。（6）棄上清，沿離心管壁加入1mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，12 000rpm 4℃離心5min，棄去上清。（7）室溫干燥RNA沉淀5～10min，不可離心或加熱干燥，否則RNA的溶解性會(huì)大大降低。（8）加入100μL RNase去離子水，55℃放置10min使RNA溶解。（9）取2μL樣品加入DEPC-H2O稀釋到50μL，紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度A260、A280及A260 /A280比值，要求A260 / A280比值為1.8～2.0。

2.1.2 Survivin抑制效應(yīng)的檢測(cè)（RT-PCR法） 根據(jù)GeneBank中Survivin基因序列，應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以β-actin為對(duì)照。

上游引物5'-GAATTCGGTATGGCCCCGACGCCGTT-3’

下游引物5’-AGATCTTTCTTCTTATTGTTGTCCGTT-3’

2.1.2.1 配制反轉(zhuǎn)錄液 MgCl22μL、RNase Free dH2O 3.75μL、10×Buffer 1μL、RNase inhibitor 0.25μL、dNTP Mixture（各10mmol/L） 1μL、Random 9 mers 0.5μL、AMV Reverse Transcriptase 0.5μL、試驗(yàn)樣品RNA（≤500ng Total RNA）1μL使總反應(yīng)液為10μL/Sample。反轉(zhuǎn)錄條件為：30℃10min、42℃ 30min、99℃ 5min、5℃ 5min。

2.1.2.2 配制PCR反應(yīng)液 5×PCR Buffer 10μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL、上游特異性PCR引物0.5μL、下游特異性PCR引物 0.5μL，再加無(wú)菌蒸餾水使總反應(yīng)液達(dá)40μL。把反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液加到PCR反應(yīng)液中，輕輕混勻。按以下條件進(jìn)行PCR：94℃2min1 Cycle；（94℃30sec、59℃30sec、72℃4min）30 Cycles。

2.1.2.3 電泳檢測(cè) 取PCR反應(yīng)液5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5μg/mL溴化乙錠），室溫，100V，電泳30min。

2.2 基因表達(dá)水平Survivin抑制效應(yīng)的檢測(cè)[11]

2.2.1 蛋白質(zhì)的樣品制備 用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞3次，加入450μL全細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打破碎細(xì)胞，冰上放置30min，吸取懸液，14 000rpm離心15min，上清即為所需蛋白，分裝備用，于-70℃保存。

2.2.2 SDS-PAGE電泳 （1）蛋白質(zhì)樣品與樣品處理液以1∶1混合，煮沸中3min。充分混合后，微量管吸取50μg樣品上樣。（2）4%濃縮膠，80V；10%分離膠，120V，電泳至所需位置，停止電泳。（3）電泳結(jié)束后取出凝膠，在Tris-甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒，再用半干電轉(zhuǎn)印法將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，注意排盡氣泡，250mA恒流，20h（PVDF膜，孔徑為0.45μm）。（4）封閉：37℃，用封閉液（含5%BSA的PBS）洗PVDF膜，盡量洗去沾附的凝膠，室溫下?lián)u床輕輕震動(dòng)3h。（5）抗體雜交：將封閉后的雜交膜放入封閉液洗3次，每次5min；再將膜放入雜交袋中，加入適當(dāng)?shù)囊豢梗ㄒ豢狗謩e為兔抗人Survivin單克隆抗體，1∶500；β-actin多克隆抗體1∶3000），去除袋內(nèi)所有氣泡，封口，4℃輕輕振蕩2h；打開雜交袋，PBS洗3次，每次10min洗去未結(jié)合的一抗；再將膜轉(zhuǎn)移到洗滌液中，室溫振蕩10min，重復(fù)2次，將膜放入一塑料袋內(nèi)，加入二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗1∶2000），封閉，室溫下振動(dòng)1h，取出膜于洗滌液中洗3次，每次10min。（6）顯色：PBS洗膜4次，每次10min，注意避光，將膜放入顯色盒中，再加混合好的ECL顯色液，反應(yīng)3min后立即用水洗膜Bio-Rad ChemDoc成像系統(tǒng)分析。

3 結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)錄水平Survivin抑制效應(yīng)的測(cè)定[12]

RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Survivin基因表達(dá)結(jié)果，空白組、空質(zhì)粒組和siRNA- SVV -2組均有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，而siRNA- SVV -1組在400bp處條帶變暗，表明siRNA-SVV-1對(duì)Survivin mRNA的抑制具有特異性，能導(dǎo)致Survivin基因的沉默，達(dá)到轉(zhuǎn)錄水平較為有效的抑制。見(jiàn)圖1。

3.2 基因表達(dá)水平Survivin抑制效應(yīng)的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48h之后經(jīng)Western blot檢測(cè)，各組間β-actin蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異，說(shuō)明各組間點(diǎn)樣量基本相同，且各質(zhì)粒對(duì)β-actin蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響?？瞻捉M、空質(zhì)粒組及siRNA-SVV-2組Survivin蛋白條帶無(wú)明顯變化；而siRNA-SVV-1組與其他組比較，蛋白條帶明顯減弱，，明顯抑制了Survivin蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

4 討論

siRNA可抑制Survivin基因的轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物減少，因此，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)Survivin在轉(zhuǎn)錄水平的抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性重組質(zhì)粒組能顯著地抑制Survivin mRNA，與對(duì)照組之間形成鮮明對(duì)比，RNAi效應(yīng)在48h最強(qiáng)，72h開始下降，4 ～ 5d后RNAi效應(yīng)逐漸消失，基因表達(dá)又恢復(fù)到干擾前水平。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：siRNA干擾有效，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)Survivin有抑制效應(yīng)。

圖1 RT-PCR電泳檢測(cè)結(jié)果圖

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)Survivin在基因表達(dá)水平上的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示同樣達(dá)到了抑制效果。RNAi技術(shù)作為基因診斷、治療的新手段具有很高的潛力，可為腫瘤發(fā)生、發(fā)展的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究提供新靶點(diǎn)，為今后的基因治療提供新途徑。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤Survivin基因的研究以期探索神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等分子機(jī)制，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基因治療提供新途徑、新靶點(diǎn)，以期提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的治愈率、生存率。

RNAi在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤中具有效果顯著、特異性較高等特點(diǎn)，小干擾RNA的長(zhǎng)度在21 ～ 28個(gè)核苷酸之間，RNAi能夠結(jié)合到與之互補(bǔ)Survivin基因的mRNA鏈上，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默，指導(dǎo)細(xì)胞的定向分化，改變基因表達(dá)水平，達(dá)到基因調(diào)控的目的。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)Survivin基因設(shè)計(jì)特異性siRNA，構(gòu)建Survivin-siRNA表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中，引起Survivin基因沉默，觀察SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)變化及Survivin表達(dá)水平的變化，以尋找Survivin在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基因治療尋找新靶點(diǎn)。

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Determination of RNA interference in suppression effect of the Survivin gene

BI Feng1YANG Mingyan1YANG Shuoyan2

1.Neuropsychiatric Hospital of Jilin Province, Siping 136000, China; 2.Changchun University of Science and Technology, Changchun 130022, China

ObjectiveTo determinate the inhibition effects of Survivin gene using RNAi technology to silence Survivin gene.MethodsThe application of RNAi technology through detecting the gene expression of Survivin RTPCR and Western-blot method.ResultsThe expression of Survivin gene in the observation group was significantly lower than that in the control group (P＜0.01), achieved the suppression effect; using Western blot to detect the expression of Survivin inhibition on the gene level, reached the same inhibitory effect.ConclusionThe inhibition of cell growth by silencing Survivin gene RNA interference technology, and promote apoptosis. The results show that the Survivin gene is involved in signal transduction, is expected to become a new target of gene therapy.

Survivin gene; Inhibition effects;RNA interference technology

R73

B

2095-0616（2015）05-33-03

2015-01-14）