沈　偉，張一文，李赫宇（.山東中醫(yī)藥高等專科學校，山東煙臺6499；.天津市益倍建生物技術有限公司，天津300457）

大川芎方HPLC指紋圖譜方法學研究

沈偉1，張一文1，李赫宇2
（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東煙臺264199；2.天津市益倍建生物技術有限公司，天津300457）

摘要：建立大川芎方HPLC指紋圖譜方法學。考察色譜條件，選擇合適的分析波長，考察方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等。結果表明：色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱，流動相甲醇-1%醋酸梯度洗脫：0 min→35 min，A：5%→35%；35 min→50 min，A：35%→80%；50 min→60 min，A：80%→80%；60 min→65 min，A：80%→5%；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測波長270 nm。在上述條件下，所建立方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等良好。所建立的大川芎方HPLC指紋圖譜方法學為該方的定性、定量分析提供了新方法。

關鍵詞：大川芎方；高效液相色譜；指紋圖譜

大川芎方源于金·劉完素《宣明論方》，由川芎、天麻兩味藥組成。川芎，又名大川芎，為傘形科多年生草本植物川芎的根莖，為四川特產藥材，性味辛溫，有活血行氣，祛風止痛之功，諸多月經不調、痛經、頭痛等的藥膳中多用川芎。天麻具有對神經細胞損傷的保護、抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠等作用[1]，同時亦具有較高的營養(yǎng)價值與保健功效，在民間有很多種做法，常用于保健食療[2]。川芎、天麻配合使用，即可作為治療偏頭痛的經典中藥復方，同時又是制備保健食品的常用配對原料[3]。由于方中川芎和天麻所含化學成分分子結構、極性等差異較大，在目前的文獻報道中，一般需分別建立定性、定量分析方法。本文建立了大川芎方的HPLC指紋圖譜分析方法，能簡便、快速、準確地進行定性、定量分析，為該方與相應保健食品的質量控制提供了有效手段。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

洋川芎內酯 I對照品（批號：140226，純度HPLC≥98%）：成都克洛瑪生物科技有限公司；阿魏酸對照品（批號773-9001）：中國藥品生物制品檢定所；天麻素對照品（批號110807-200205）：中國藥品生物制品檢定所；川芎藥材經山東中醫(yī)藥高等專科學校中藥鑒定教研室張欽德教授鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖：購于上海泰坤堂中醫(yī)院（產地云南，批號20121028）；天麻藥材經山東中醫(yī)藥高等?？茖W校中藥鑒定教研室張欽德教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata B1.的干燥塊莖：購于上海泰坤堂中醫(yī)院（產地云南，批號20121028）。

甲醇：色譜級，美國天地（TEDIA）試劑公司；其余試劑為分析純。

1.2儀器

SHIMADZU高效液相色譜儀（LC-2010A HT），配備DAD二極管陣列檢測器、四元泵、自動進樣器、LC-solution色譜工作站；TU-1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：HypersilODS2C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-1%醋酸，按表1程序梯度洗脫；柱溫：30℃；流速：1 mL/min。

表1　流動相梯度洗脫變化程序Table 1　The gradient elution procedure

1.3.2供試品溶液的制備

1.3.2.1川芎效應組分的制備方法

川芎粗粉，分別加12倍量、10倍量、8倍量70%乙醇，回流提取3次（1.5、1、0.5 h），濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，真空干燥，得川芎效應組分干浸膏。

1.3.2.2天麻效應組分的制備方法

天麻粗粉，加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，真空干燥，得天麻效應組分干浸膏。

1.3.2.3大川芎方供試品溶液的制備方法

稱取川芎、天麻干浸膏（生藥量4∶1）于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解10 min，經0.45 μm有機相微孔濾膜濾過，即得60 mg/mL的大川芎方供試品溶液。

1.3.2.4阿魏酸對照品溶液的制備方法

精密稱取FA對照品4.6 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得46 μg/mL的FA對照品溶液。

1.3.2.5天麻素對照品溶液的制備方法

精密稱取GS對照品3.0 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得30 μg/mL的GS對照品溶液。

1.3.2.6洋川芎內酯I對照品溶液的制備方法

精密稱取SI對照品14.8 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1.48 mg/mL的SI對照品儲備液。精密量取1 mL儲備液于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得14.8 μg/mL的SI對照品溶液。

2　結果與分析

2.1檢測波長的選擇

精密量取川芎、天麻效應組分干浸膏，分別置100 mL容量瓶中，另取100 mL容量瓶，按川芎、天麻生藥量4∶1的比例稱取干浸膏，均加甲醇稀釋至刻度，超聲溶解。精密吸取一定量的川芎效應組分溶液、天麻效應組分溶液和大川芎方效應組分溶液，轉移置100 mL容量瓶中，制成0.4 mg/mL的川芎供試品、1.0 mg/mL的天麻供試品和3.0 mg/mL的大川芎方供試品，以甲醇為空白，在200 nm～400 nm波長范圍內進行掃描。結果見圖1。

圖1　全波長掃描圖Fig.1　Full-wavelength scan diagram

根據(jù)紫外掃描結果可知，川芎效應組分在280 nm 和320 nm波長下均有較穩(wěn)定的吸收。天麻效應組分在270 nm波長下有較穩(wěn)定的吸收。大川芎方效應組分在280 nm波長下有較穩(wěn)定的吸收。

本試驗重點考查了大川芎方效應組分270、280、320 nm檢測波長下的色譜圖，見圖2。

圖2　大川芎方HPLC圖譜Fig.2　HPLC fingerprint diagram of Dachuanxiong formula

結果表明：270 nm色譜圖各色譜峰的響應值較高，出峰數(shù)目多，故檢測波長定為270 nm。

2.2參照物的選擇

FA對照品、GS對照品、SI對照品的色譜圖見圖3。

圖3　對照品色譜圖Fig.3　Chromatogram of three reference substances

其中保留時間為31.1 min的FA色譜峰（見圖3，3號峰）是HPLC圖譜中峰面積較大、出峰時間適中且很穩(wěn)定的色譜峰，選擇該峰作為參照。

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗

取同一批次大川芎方效應組分干浸膏，制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定。結果：各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD<5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重現(xiàn)性試驗

取同一批次大川芎方效應組分干浸膏，平行制備6份供試品溶液，測定。結果：各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD<5%，表明方法重現(xiàn)性良好。2.3.3穩(wěn)定性試驗

取同一批次大川芎方效應組分干浸膏，制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進樣分析，測定。結果：各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD<5%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.4指紋圖譜的測定及結果

制備10批川芎、天麻效應組分干浸膏，并按供試品溶液制備方法平行制備10份供試品溶液，測定HPLC色譜圖，記錄65 min的色譜圖譜，結果見圖4。

圖4　大川芎方效應組分10批樣品指紋圖譜Fig.4　HPLC fingerprints of 10 batch samples of Dachuanxiong formula effective extracts

經與圖3對照品色譜圖比較得知，1號峰為GS峰，3號峰為FA峰，6號峰為SI峰。以FA色譜峰的保留時間和峰面積的積分值為1，計算各共有峰的相對保留時間和峰面積比，其值RSD<5%。結果表明，所建立的指紋圖譜分析方法有較好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性，可用于大川芎方的定性、定量分析。

3　討論

以往的大川芎方研究者常以其中的一到兩種主要成分（FA、GS）作為研究指標，但川芎、天麻所含化學成分較為復雜，僅以一到兩種成分為指標進行研究顯然無法體現(xiàn)該方的整體作用特點，故建立大川芎方化學成分的指紋圖譜是十分必要的。本文所建立的大川芎方效應組分HPLC指紋圖譜測定方法，方法學研究表明所建立的方法準確、穩(wěn)定、簡便易行，色譜圖中色譜峰最為豐富，能相對全面的反映出大川芎方中所含的復雜化學成分體系，不僅可以用于大川芎方、大川芎方制劑或川芎、天麻藥對藥膳、保健食品物質基礎的探究，也可以為該方及相應保健食品的質量控制提供強有力的技術手段。

參考文獻：

[1]W Liu,B L Su,Z S Wang,et al.Gastrodin Improved Baroreflex Sensitivity and Increased Gamma-Amino Butyric Acid Content in Brains without Decreasing Blood Pressure in Spontaneously Hypertensive Rats[J].CNS Neurosci Ther,2012,18:873-875

[2]趙楊,康志嬌,周欣,等.藥食兩用植物-天麻[J].貴州師范大學學報(自然科學版),2013,31(4):9-12

[3]L Wang,J Zhang,Y Hong,et al.Phytochemical and Pharmacological Review of Da Chuanxiong Formula:A Famous Herb Pair Composed of Chuanxiong Rhizoma and Gastrodiae Rhizoma for Headache[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:42,53,69

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.041

收稿日期：2015-07-02

作者簡介：沈偉（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：中藥化學與中藥炮制學。

The HPLC Fingerprint Analysis of Dachuanxiong Formula

SHEN Wei1，ZHANG Yi-wen1，LI He-yu2
（1.Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai 264199，Shandong，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.Ltd.，Tianjin 300457，China）

Abstract：To develop HPLC chromatographic fingerprint for Dachuanxiong formula.The chromatographic conditions were investigated，the proper analytical wavelength was inspected，and theprecision，reproducibility and stability were determined.Chromatographic conditions：A Hypersil ODS2 C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）was applied with the gradient elution solvent system composing of methanol（A）and 1%acetic acid water（B）：0 min→35 min，A：5%→35%；35 min→50 min，A：35%→80%；50 min→60 min，A：80%→80%；60 min→65 min，A：80%→5%.The column temperature was 30℃and the flow rate was 1 mL/min.The signal was acquired at 270 nm.Under the conditions we investigated，the precision，reproducibility and stability of the HPLC chromatographic fingerprint method were good.The HPLC chromatographic fingerprint method established in this paper applied a new method for qualitative and quantitative for Dachuanxiong formula.

Key words：Dachuanxiong formula；HPLC；fingerprint