石　蕾，耿金峰，馬欣欣，馬衛(wèi)敬，楊巧利，吳　洪（新奧科技發(fā)展有限公司煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊065001）

4種富油微藻產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景比較研究

石蕾，耿金峰，馬欣欣，馬衛(wèi)敬，楊巧利，吳洪*
（新奧科技發(fā)展有限公司煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊065001）

摘要：為了篩選具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的富油微藻，以實驗室保藏的4株淡水和海洋微藻為研究對象，在室外自然條件下利用光徑為3 cm和5 cm板式光生物反應(yīng)器通氣分批培養(yǎng)，通過測定微藻培養(yǎng)物的生物量和總脂含量等指標，從中篩選生長速度快、生物量和總脂含量高的微藻。結(jié)果表明：4株微藻的生物量產(chǎn)率和總脂含量分別在0.099 g/（L·d）～0.201g/（L·d）和20.4%dw～40.1%dw（%Dryweight）之間，分別是眼點擬微綠球藻（Nannochloropsisoculata）[0.201 g/（L·d），40.1%dw]、荒漠柵列藻（Scenedesmusdeserticola）[0.099g/（L·d），30.8%dw]、雙形柵藻（Scenedesmusdimorphus）[0.142g/（L·d），20.4%dw]、若夫小球藻（Chlorallazofingensis）[0.155 g/（L·d），29.3%dw]，其中最具產(chǎn)業(yè)化潛力的微藻為眼點擬微綠球藻（Nannochloropsisoculata），其總脂產(chǎn)量和單位體積總脂產(chǎn)率分別為1.409 g/L和108.353 mg/（L·d），其中二十碳五烯酸（EPA）含量占干重含量的7.2%，是較優(yōu)的EPA生產(chǎn)原料。

關(guān)鍵詞：微藻；生物量；總脂含量；總脂產(chǎn)量；單位體積總脂產(chǎn)率；EPA

微藻是一類資源豐富、種類繁多、生長速度快、具有極大應(yīng)用價值的生物資源。微藻及其代謝產(chǎn)物可用于天然食品加工、生物餌料、生物制藥、生物肥料、污水處理、可持續(xù)生物能源生產(chǎn)等方面，具有重要的經(jīng)濟價值和社會價值[1]。

目前，國內(nèi)外用于生物能源工業(yè)生產(chǎn)的原料油脂主要來自植物油和動物油，都存在著產(chǎn)量低、成本高、經(jīng)濟性差等缺點，而且不能持續(xù)提供[2]。微藻可以通過光合自養(yǎng)將太陽能轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化學(xué)能，許多微藻在一定條件下能夠在細胞中大量積累三酰甘油（TGA），有些藻種的總脂含量可占細胞干重的50%以上[3-4]，且油脂產(chǎn)量要遠遠高于其它高等產(chǎn)油植物，且有些微藻油中不飽和脂肪酸含量也非常高。因此，綜合產(chǎn)量和品質(zhì)考慮，微藻油是非常優(yōu)質(zhì)的生物油脂原料[5]。此外小球藻、螺旋藻等單細胞微藻類含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、生物多糖、葉綠素、類胡蘿卜素及人體所需的各種礦物質(zhì)等[6]，有優(yōu)異的營養(yǎng)保健功能，也可用于美容和生產(chǎn)化妝品，多用途開發(fā)潛力非常大。

從自然界中篩選到生長速度快、產(chǎn)量和含油量高、抗逆性強的優(yōu)質(zhì)藻種，是實現(xiàn)富油微藻產(chǎn)業(yè)化的前提。本研究利用新奧（ENN）微藻室外培養(yǎng)平臺，對已經(jīng)過ENN室內(nèi)評價的4株優(yōu)質(zhì)野生型淡水和海洋微藻進行了室外生長和產(chǎn)油性能評價，為進一步實現(xiàn)微藻生物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論和技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1藻種

試驗藻由ENN生物質(zhì)能源技術(shù)中心藻種質(zhì)庫提供，各藻種的具體信息見表1。

表1　藻種類型和生長環(huán)境Table 1　Microalgae species and their habitats

1.2培養(yǎng)基配制

藻細胞培養(yǎng)采用的是人工海水培養(yǎng)基和BG11配方，配方參見文獻[7-8]。采用經(jīng)漂白粉消毒后的自來水，全部使用分析純藥品。生長實驗使用的為全氮正常培養(yǎng)基，油脂誘導(dǎo)實驗使用的為1/3氮培養(yǎng)基。

1.3培養(yǎng)條件

室外培養(yǎng)在河北廊坊新奧科技園生態(tài)城陽光大棚中進行，生長實驗采用規(guī)格為100 mm×100 mm× 50 mm的玻璃板式反應(yīng)器，油脂誘導(dǎo)實驗采用規(guī)格為100 mm×100 mm×30 mm的玻璃板式反應(yīng)器；培養(yǎng)過程中光照、溫度等不予調(diào)控，每日跟蹤測定。

1.4試驗設(shè)計

將室內(nèi)培養(yǎng)的藻種接入Φ6 cm柱狀玻璃光反應(yīng)器中，室外通氣培養(yǎng)5 d～6 d后，再離心濃縮，接種到相應(yīng)規(guī)格的玻璃板式反應(yīng)器中：生長實驗接種至50 mm光程反應(yīng)器中，使用全氮培養(yǎng)基；油脂誘導(dǎo)實驗接種至30 mm光程反應(yīng)器中，使用1/3氮培養(yǎng)基。每株藻設(shè)置兩個平行。實驗周期為15 d。生長實驗每天測定干重。油脂誘導(dǎo)實驗每天測定干重，實驗后期每隔兩天測定總脂肪含量。

1.5測定方法

1.5.1生物量（干重Dry weight，dw）的測定

waltman纖維濾膜（0.45 μm）105℃烘干至恒重，干燥器中冷卻后稱重W0，取一定體積藻液V抽濾，再置于105℃烘箱中烘至恒重，干燥器中冷卻后稱重W1，干重/（g/L）=（W1-W0）/V。

1.5.2總脂含量測定

凍干藻粉a1（g）放置在具Telfnon螺口瓶蓋小玻璃瓶中，加入10%DMSO-Methanol溶液，40℃砂浴磁力攪拌5 min；然后在4℃下磁力攪拌抽提，離心，上清液轉(zhuǎn)移到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的diethyl ether-hexane 4℃下磁力攪拌抽提1 h，離心后轉(zhuǎn)移上清液到上述抽提液瓶中。重復(fù)上述過程直到藻渣變白。在抽提液中加入純水，振蕩分相，移取有機相轉(zhuǎn)移到另一小玻璃瓶中，用氮氣吹干至恒重后，稱重為a2（g）。

總脂含量Lipid content/（%dw）=a2/a1×100

1.5.3單位體積生物量產(chǎn)率、單位體積總脂產(chǎn)率

生物量產(chǎn)率 Biomass volumetric productivity/[g/ （L·d）]=（mt-m0）/（t-t0）

單位體積總脂產(chǎn)率Lipid volumetric productivity （mg/L·d）=mt×Lt/（t-t0）

總脂產(chǎn)量Lipid yield（g/L）=mt×Lt

式中：mt為收獲時藻的干重，（g/L）；m0為接種時藻的干重，（g/L）；Lt為收獲時總脂含量，（%dw）；t為試驗結(jié)束時間，d；t0為試驗起始時間，d。

1.5.4脂肪酸含量分析

由譜尼測試科技股份有限公司分析檢測，采用GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》方法。

2　結(jié)果與討論

2.1室外養(yǎng)殖條件下4種藻的生長曲線及生物量產(chǎn)率比較

室外養(yǎng)殖條件下4種藻的生長曲線及生物量產(chǎn)率比較見圖1。

圖1　4株微藻干重隨時間的變化圖Fig.1　Dry weight of four microalgae changes with time

在室外自然光條件下，不同藻種的細胞生長情況各不相同，由圖1可見，4種藻初始干重在0.354 g/L～0.421 g/L之間，室外養(yǎng)殖14 d后，終濃度差別較大，N. oculata最高為3.211 g/L，S.deserticola最低為1.743 g/L，前者為后者的1.84倍。具體分析結(jié)果見圖2。

圖2　4株微藻生物量產(chǎn)率比較Fig.2　Comparison of biomass volumetric produtivity of four microalgae

N.oculata產(chǎn)率為0.201 g/（L·d），其后依次為C. zofingensis 0.155 g/（L·d），S.dimorphus為0.142 g/（L·d），S.deserticola最低為0.099 g/（L·d），N.oculata的產(chǎn)率明顯高于其他藻。各種細胞在室外條件下的生長速率差別較大，N.oculata生長一直處于對數(shù)生長時期，14 d的比生長速率為0.204；S.deserticola生長從第2天經(jīng)歷了6 d的對數(shù)生長時期，比生長速率為0.143。S. dimorphus生長從第2天經(jīng)歷了9 d的對數(shù)生長時期，比生長速率為0.197；C.zofingensis從第2天開始經(jīng)歷了9 d的對數(shù)生長期，比生長速率為0.216。由此可知N.oculata是4株藻生長速度最快的藻株。

2.2室外養(yǎng)殖條件下4種藻的產(chǎn)油潛力比較

室外養(yǎng)殖條件下4種藻的產(chǎn)油潛力比較見圖3。

圖3　4種藻總脂含量變化趨勢圖Fig.3　The contents of total lipid of four typical microalgae changes with time

由圖3可知N.oculata和C.zofingensis總脂含量都是逐漸升高的趨勢，而S.deserticola和S.dimorphus的總脂含量在第10天達到最高。并且不同種類微藻總脂含量差異較大，養(yǎng)殖13天后，N.oculata的總脂含量達到40.1%dw，而其他3個藻的總脂含量在20.4%dw～30.8%dw之間。

總脂產(chǎn)量是總脂含量和生物量乘積，表征的是養(yǎng)殖過程中最終實際獲得的油脂總量（g/L）。4種藻的總脂終含量、總脂單位體積產(chǎn)率和總脂產(chǎn)量見表2。

表2　4種藻的總脂終含量、總脂單位體積產(chǎn)率和總脂產(chǎn)量Table 2　Total lipid content，lipid volumetric productivity，lipid yield of four microalgae

由表2可知，N.oculata的總脂含量、總脂產(chǎn)率和總脂產(chǎn)量都明顯高于其他3個藻，具有較高的產(chǎn)業(yè)化潛力。2.3眼點擬微綠球藻（N.oculata）藻粉品質(zhì)分析

眼點擬微綠球藻（N.oculata）藻粉品質(zhì)分析見表3、表4。

表3　N.oculata各成分組成Table 3　The composition of N.oculatas

表4　N.oculata脂肪酸成分Table 4　The fatty acid composition of N.oculata

由表3可知N.oculata細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量達到細胞干重的23.5%，并且油脂含量極其豐富，高達細胞干重的40%以上。由表4可知N.oculata脂肪酸成分中以棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1）、花生四烯酸（C20∶4）和EPA（C20∶5）為主，分別占干重含量的13.7%、8.8%、2.8%、3.1%和7.2%，是難得的單細胞蛋白生產(chǎn)、脂肪酸保健食品和水產(chǎn)育苗的代用餌料。

3　結(jié)論

富油微藻可作為保健品和食品添加劑，也是生物柴油生產(chǎn)的理想原料，它逐漸成為各國政府和藻類學(xué)家關(guān)注的焦點，例如眼點擬微綠球藻（N.oculata）具有生長速度快、含油量高等優(yōu)點，且其脂肪酸含有大量EPA，在獲取微藻油脂的同時提取EPA，是一種綜合開發(fā)、降低微藻規(guī)?；a(chǎn)成本的有效途經(jīng)[7]。小球藻是單細胞藻類，常見的有普通小球藻（Chlorella vulgaris）、蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）、若夫小球藻（C.zofingiensis）等，若夫小球藻（C.zofingiensis）被認為是優(yōu)良的蝦青素和油脂生產(chǎn)株[8-9]。目前大規(guī)模生產(chǎn)微藻仍是一個世界難題，有大量工作需要開展。

目前對于微藻的研究集中于生長條件、營養(yǎng)方式等對其生長和油脂積累的研究，且實驗室內(nèi)研究較多。楊勛等研究得出若夫小球藻（C.zofingiensis）在自養(yǎng)方式下總脂含量為34.6%，總脂產(chǎn)量為0.69g/L[10]。李麒龍等研究為二形柵藻（S.dimorphus）室內(nèi)養(yǎng)殖20 d后生物質(zhì)產(chǎn)率和總脂產(chǎn)量均最高，分別達到了0.045g/（L·d）、和0.305 g/L[11]。李濤等研究結(jié)果是眼點擬微綠球藻（N.oculata）的生物量產(chǎn)量最高，16 d為0.47g/（L·d），總脂產(chǎn)量為2.8 g/L；若夫小球藻（C.zofingiensis）小于0.25 g/（L·d），總脂產(chǎn)量為1.3 g/L[12]，但實驗條件為24 h連續(xù)光照，所以各項數(shù)值較高。

本文中以保藏在ENN藻種室的并通過室內(nèi)油脂評價后優(yōu)選出的產(chǎn)量和含油率較優(yōu)的4株野生型的淡水和海洋微藻為研究對象，在室外自然條件下進行了生物質(zhì)產(chǎn)率、油脂含量和油脂產(chǎn)量等因素的評價。結(jié)果顯示眼點擬微綠球藻（N.oculata）的各項特性較優(yōu)，遠高于其他藻株。在室外光強下的生物質(zhì)產(chǎn)率達到0.201 g/（L·d），同時其藻細胞中總脂含量和總脂產(chǎn)量分別達到了40.1%和1.409 g/L，尤其EPA含量占干重含量7.2%，EPA屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸，是人體自身不能合成但又不可缺少的重要營養(yǎng)素。因此眼點擬微綠球藻（N.oculata）不論是生物量產(chǎn)率、總脂含量還是脂肪酸成分，均為較優(yōu)的生物油脂原料，日后通過養(yǎng)殖工藝如反應(yīng)器、培養(yǎng)基、曝氣方式、采收方式等優(yōu)化，獲得更高的生產(chǎn)效率，服務(wù)于富油微藻的規(guī)模化培養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

參考文獻：

[1]鄒寧,李艷,孫東紅.幾種有經(jīng)濟價值的微藻及其應(yīng)用[J].煙臺師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,21(1):59-63

[2]Spolaore P,Joannis-Cassan C,Duran E,et al.Commercial Applications of Microalgae[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006,101(2):87-96

[3]Williams P,Laurens L.Microalgae as biodiesel and biomassfeedstocks:review and analysis of the biochemistry and economics[J]. Energy EnvionSci,2010,3(5):554-590

[4]Chisti Y.Biodiesel from microalgae[J].BiotechnolAdv,2007,25(3): 294-306

[5]王付冬,桑敏,李愛芬,等.光照對眼點擬微綠球藻和三角褐指藻生長及總脂的影響[J].中國油脂,2010,35(6):71-75

[6]Borowitzka M A.Microalgae as sources of pharmaceuticals and other biologically active compounds[J].J ApplPhycol,1995,7(1):3-15

[7]盧美貞,沈林杰,陸向紅.培養(yǎng)條件對眼點擬微綠球藻油脂含量和EPA產(chǎn)率的影響[J].中國糧油學(xué)報,2014,5(29):80-89

[8]王艷,黃俊潮,陳峰.小球藻生物合成蝦青素的應(yīng)用前景[J].食品工業(yè)科技,2007,28(12):230-233

[9]許謹,張成武,李愛芬,等.華南地區(qū)淡水產(chǎn)油微藻藻株的分離與篩選[J].可再生能源,2011,29(1):66-71

[10]楊勛,郝宗娣,張森營,等.營養(yǎng)元素和pH對若夫小球藻生長和油脂積累的影響[J].南方水產(chǎn)科學(xué),2013,9(4):34-38

[11]李麒龍,林向陽,王靜.營養(yǎng)條件對二形柵藻生長及生化組分的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2014,30(17):46-50

[12]李濤,李愛芬,桑敏,等.富油能源微藻的篩選及產(chǎn)油性能評價[J].中國生物工程雜志,2011,31(4):98-105

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.002

收稿日期：2015-06-10

基金項目：國家“973”計劃重點項目（微藻高效固碳產(chǎn)能應(yīng)用基礎(chǔ)研究2012CB723606）

作者簡介：石蕾（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，從事微藻養(yǎng)殖與光反應(yīng)器制造等方面研究。

*通信作者：吳洪（1963—），女（漢），國家“千人計劃”，博士，主要從事微藻藻種選育和高效養(yǎng)殖方式研究。

A Com Parison Study on the Commercial Prospects for Four Types of Lipid-rich Microaegse

SHI Lei，GENG Jin-feng，MA Xin-xin，MA Wei-jing，YANG Qiao-li，WU Hong*
（State Key Laboratory of Coal-based Low Carbon Energy，ENN Science&Development Co.，Ltd.，Langfang 065001，Hebei，China）

Abstract：Four strains of freshwater and marine microalgae collected in laboratory were screened for their potential of oil production for industrial application.All microalgae were cultured in batch，with flat plate photobioreactors（light path，3 cm and 5 cm）.These microalgae were evaluated by measuring biomuss，total lipid content，total lipid yield，total lipid volumetric productivity.The results showed that the biomuss yield and total lipid contents of four microalgae were in the range of 0.099 g/（L·d）-0.201 g/（L·d）and 20.4%dw-40.1%dw，respectively，includingNannochloropsisoculata[0.201 g/（L·d），40.1%dw]，Scenedesmusdeserticola[0.099g/（L·d），30.8%dw]，Scenedesmusdimorphus[0.142g/（L·d），20.4%dw]，Chlorallazofingensis[0.155g/（L·d），29.3%dw].It was concluded that the most potential for industrial application was Nannochloropsisoculata，which lipid yield andlipidvolumetric productivity was1.409g/Land108.353mg/（L·d），respectively.The content of EPA was 7.2% dw，was the more excellent EPA production of raw materials.

Key words：microalgae；Biomass；lipid content；lipid yield；Lipid volumetric productivity；EPA