邵　璐，侯丹陽，冷再君，徐修才，伍　權，操樂杰

sARMS-PCR檢測非小細胞肺癌腫瘤組織中KRAS、BRAF基因突變研究

邵璐1，侯丹陽1，冷再君1，徐修才2，伍權2，操樂杰1

摘要目的針對非小細胞肺癌（NSCLC）患者組織標本鼠類肉瘤病毒癌基因同源基因（KRAS）和鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（BRAF）驅動基因突變使用特異引物雙擴增實時蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（sARMS-PCR）檢測的可行性；了解KRAS和BRAF基因突變患者臨床病理特征，為NSCLC患者個體化治療提供理論依據。方法收集89例NSCLC患者腫瘤組織甲醛固定石蠟包埋標本（FFPE），采用FFPE樣品DNA分離試劑盒（離心柱型）提取DNA，使用sARMS-PCR同時進行KRAS及BRAF基因突變檢測。結果①KRAS基因突變21例（21／89）；其中KRAS基因7種熱點突變中，檢出6種熱點突變，均位于第12、13位密碼子，1例同時檢出存在G12D及G12V位點突變，1例同時檢出存在G12C及G12V位點突變；未發(fā)現G12S突變型；②BRAF基因突變1例（1／89），突變位點為V600E，為女性，黏液腺癌；③未見KRAS和BRAF基因同時突變現象。結論臨床使用sARMS-PCR技術檢測NSCLC患者KRAS和BRAF基因突變有較強敏感性，且石蠟組織標本取材方便，可以作為兩種基因的臨床檢測方法；KRAS和BRAF基因突變與年齡、吸煙史、病理分型等均無明顯相關性，KRAS基因突變與性別相關，男性高于女性；KRAS與BRAF基因是獨立存在的。

關鍵詞非小細胞肺癌；鼠類肉瘤病毒癌基因同源基因；鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1；特異引物雙擴增即時PCR技術

2015-07-15接收

操樂杰，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：sycaolejie＠163．com

針對驅動基因的靶向治療藥物逐漸成為目前肺癌個體化治療研究的熱點，主要集中在包括表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在內的數個信號轉導途徑，尤其是表皮生長因子受體絡氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase Inhibitors，EGFR-TKI）藥物的研發(fā)及臨床應用，延長了非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的生存期，EGFR基因突變與EGFR-TKI的相關性已經得到了很好的驗證［1-4］。但臨床觀察顯示，雖然有部分患者存在EGFR基因突變，但對EGFR-TKI的治療效果變異很大，可能與RAS-RAF-絲裂原激活蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）-細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）信號傳導系統(tǒng)的下游信號因子鼠類肉瘤病毒癌基因同源基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）或鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（V-rafmurine sarcoma viral oncogene homologB1，BRAF）基因突變部分相關［5］，因此給患者行TKI治療前僅僅檢測EGFR是否突變可能不夠全面，在行EGFR基因突變檢測同時需行KRAS和BRAF突變檢測有利于做出更全面的治療決策。目前KRAS、BRAF基因檢測主要有直接測序法、焦磷酸測序法、高分辨率熔解曲線分析法（high resolution melting，HRM）等，但大多存在敏感性低、易污染等問題，而特異引物雙擴增實時蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplitieafionrefractory mutationsystem，ARMS）因其高敏感性、高特異性等優(yōu)勢受到臨床廣泛歡迎。該研究旨在對KRAS、BRAF基因突變的檢測確立臨床檢驗方法及兩種基因與臨床病理特征關系進行探討，為肺癌個體化治療提供實驗依據。

1　材料與方法

1．1標本來源選取安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院2013年1月～12月NSCLC組織學石蠟包埋組織標本89例，其中經胸外科手術切除標本83例，鎖骨上轉移性淋巴結活檢3例，肺穿刺活檢1例，惡性胸腔積液2例。標本經病理學確診為NSCLC，均為甲醛固定石蠟包埋標本。標本采集前均未接受任何抗腫瘤治療，無其他原發(fā)腫瘤病史?；颊吲R床資料主要包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤類型、TNM分期等；分期依據2011年由國際肺癌研究學會（IASLC）、美國胸科學會（ATS）及歐洲呼吸學會（ERS）制定的肺癌的國際多學科分類標準。

1．2主要試劑甲醛固定石蠟包埋標本（formalinfixed paraffin-embedded，FFPE）樣品DNA分離試劑盒（離心柱型）、人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒（熒光實時PCR）、人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒（熒光實時 PCR）均購自廈門艾德生物科技有限公司。

1.3FFPE標本處理及DNA提取所有石蠟組織標本均經病理學確診，且腫瘤細胞含量≥10%，佩戴一次性手套，使用徠卡手動切片機連續(xù)切取每份FFPE標本，切片厚度為5μm，共8～10張，放置離心管中備用，更換FFPE標本時需用 75%乙醇溶液擦拭切片機，避免切片機上殘余的蠟塊交叉污染。所有標本應用FFPE樣品DNA分類試劑盒（離心柱型）提取DNA，具體操作步驟按說明書進行。提取的DNA均使用SMA4000超微量紫外分光度計（AmoyDx北京儀器有限公司）行濃度測定，DNA的260 nm和280 nm處光密度（optical delnsity，OD）比值 OD260／OD280均在 1．8～2．0，并放置-20℃環(huán)境保存。

1.4KRAS、BRAF基因檢測所提取的DNA分別根據人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒（熒光實時PCR），人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒（熒光實時PCR）所附說明書的步驟操作并運用Applied Biosystems 7500實時PCR及操作系統(tǒng)（美國應用生物系統(tǒng)公司）行KRAS、BRAF聯合檢測。見圖1。

1．5統(tǒng)計學處理運用SPSS 16．0軟件分析數據，基因突變狀態(tài)與臨床病理學特征采用X2檢驗。

2　結果

2．1臨床病理學資料特點本研究89例NSCLC患者，其中男54例，女35例，男女比例約為1．5∶1；年齡37～82歲，中位年齡60歲，平均水平和變異程度指標61歲，＜61歲49例，≥61歲40例；吸煙組39例，非吸煙組50例；腺癌88例，非腺癌1例；I～II期73例，III～IV期16例。

2.2KRAS及BRAF基因狀態(tài)與臨床病理特征的相關性89例NSCLC患者中，KRAS基因突變率23．6%（21／40），男17例，女4例，男性和女性突變率分別為31．5%（17／54）和11．4%（4／35），兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。吸煙者39例，檢出KRAS基因突變12例；非吸煙者50例，檢出KRAS基因突變9例，突變率分別為30．8%和18．0%，吸煙者高于非吸煙者，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期患者之間突變率差異無統(tǒng)計學意義。見表1。BRAF基因突變率2．5%（1／40），與年齡、性別、吸煙史、病理類型、分期差異均無統(tǒng)計學差異。

2.3KRAS基因突變類型分析89例NSCLC患者標本行7種KRAS基因突變類型檢測，分別為G13D、G12A、G12D、G12C、G12R、G12V、G12S，其中檢出KRAS基因突變21例，均發(fā)生在第12或13號密碼子，其中1例p．G13D，6例p．G12A，6例p．G12D，5例p．G12C，1例p．G12R，1例復合突變?yōu)閜．G12V和p．G12D，1例復合突變?yōu)閜．G12V和p．G12C，未檢出p．G12S。見表2。

表1　KRAS基因狀態(tài)與臨床病理特征的相關性（n）

2.4KRAS基因與BRAF基因共存情況89例NSCLC腫瘤標本同步行KRAS和BRAF基因檢測，同一患者未檢出KRAS、BRAF雙突變。

表2　KRAS基因突變類型分析

3　討論

RAS蛋白又稱P21蛋白，普遍存在于哺乳動物基因組中，突變的RAS蛋白持續(xù)與GTP結合處于活化狀態(tài)，引起下游信號分子持續(xù)活化，促進腫瘤細胞的增殖、存活和轉移。RAF蛋白是EGFR信號通路中KRAS下游重要的信號分子，是RAS-RAF-MEKERK信號轉導通路重要的轉導因子，其將信號從KRAS傳導至MEK1／2，參與調控細胞的生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡。在人類癌癥中突變的RAS基因編碼的蛋白質突變發(fā)生在G12、G13或Q61。1984年人類首次在肺癌中發(fā)現KRAS基因突變，主要發(fā)生在密碼子12或13。

在西方國家中，肺癌的KRAS突變率達15%～30%，低于亞裔患者［6～9］的20% ～30%，更頻發(fā)于來自吸煙者的腺癌［10-11］，KRAS突變在非吸煙肺癌患者中并不罕見，約占15%，本研究中的89例實驗標本，運用ARMS-PCR測出KRAS基因突變率為23．6%，與文獻［6～9］報道一致，吸煙者突變率為30．8%（12／39），非吸煙者突變率為18%（9／50），LCINS突變率雖略高于文獻報道，但吸煙者和未吸煙者突變率之間差異無統(tǒng)計學意義，與國外研究［18］的KRAS基因突變更常見于吸煙者的報道不一致，是否存在相關性可以擴大樣本量進一步研究。

本實驗中，KRAS基因突變與年齡、病理類型、吸煙、腫瘤分化程度等臨床病理特點無相關性，與相關報道［12-13］一致，與性別是否相關，在國內外報道中未能統(tǒng)一，本實驗中男性KRAS突變率為31．5%，女性為11．4%，差異有統(tǒng)計學意義，提示KRAS基因突變在男性中更常見。

KRAS點突變好發(fā)在第12或13號密碼子，本實驗中第12號密碼子突變率為22．5%（20／89），1例發(fā)生在第13號密碼子，突變率為1．1%（1／89），發(fā)生在第12號密碼子的突變數目遠高于第13號密碼子的突變數目，其中檢測出2例復合突變，均發(fā)生于第12號密碼子，1例為p．G12V和p．G12D，1例為p．G12V和p．G12C，均為男性，有吸煙史，腺癌患者，同時行EGFR基因檢測，結果均為野生型。

BRAF基因突變見于多種腫瘤，以直腸癌突變率最高，約15%，在黑色素瘤、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌中均存在不同比例的突變。在NSCLC中，突變率為1%～2%，其中大部分是腺癌。目前識別超過40種突變，在各種不同類型的突變中，約90% 的BRAF突變發(fā)生于谷氨酸殘基600單個替換為纈氨酸（V600E）。本研究中，只有1例患者檢測出BRAF基因突變，發(fā)生在女性，非吸煙，KRAS基因野生型患者，突變率為1．1%（1／89），研究標本量較少，可通過擴大樣本量來進一步證實突變率。在目前的研究［14］中，BRAF突變與KRAS突變是排斥存在的，本實驗中未發(fā)現KRAS和BRAF基因同時存在的病例。

原發(fā)灶和轉移灶中相關基因突變位點可能不完全相同，在使用靶向治療時，不應忽略原發(fā)灶和轉移灶可能存在基因突變位點不一致的現象。本研究中，標本選擇有3例來自于轉移性淋巴結，2例來自惡性胸腔積液，由于標本來源少，故未行原發(fā)灶及轉移灶基因突變狀態(tài)對比研究。

對于EGFR突變型的 NSCLC患者，EGFR-TKIs治療有效率為70%～80%，有20%～30%的患者存在原發(fā)性耐藥，還有些患者初始治療有效，后出現繼發(fā)性耐藥，這可能與KRAS或BRAF基因突變部分相關，因此給患者行TKI治療前僅僅檢測EGFR是否突變可能是不夠的，在行 EGFR基因突變檢測同時需行KRAS和BRAF突變檢測。

目前基因檢測方法有很多種，直接測序法仍為金標準，但存在操作復雜、易污染、特異性低等，張海萍等［15］通過對827例腫瘤病理石蠟切片樣品提取DNA，同時運用ADX-ARMs技術和測序法進行檢測，兩種檢測方法總體一致率為94．4%，突變一致率為100．0%，野生型一致率為92．5%，提示ADXARMs技術檢測突變率較高，支持了ADX-ARMs技術的優(yōu)勢，指出了ADX-ARMs技術具有較高的檢測靈敏度和可靠性。本實驗運用sARMS-PCR法對NSCLC患者石蠟包埋組織同時檢測KRAS、BRAF基因的突變狀態(tài)，檢測出基因突變率與國內外研究報道一致，臨床使用sARM-PCR技術檢測NSCLC患者KRAS基因和BRAF基因突變有較強敏感性，且石蠟組織標本取材方便，可作為這兩種基因的臨床檢測方法。

帶有KRAS第12號密碼子突變的患者和野生型相比，化療反應率相似，但帶有KRAS基因第13號密碼子突變的患者比KRAS野生型患者化療后總體反應率更差，BRAF基因是多種腫瘤的驅動基因，可能成為NSCLC患者治療的新靶點，因此NSCLC患者多基因檢測對肺癌個體化治療有重要意義。

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sARMS-PCR detection in non-small cell lung cancer tumor tissue KRAS，BRAF genemutation

Shao Lu，Hou Danyang，Leng Zaijun，etal
（Dept of Respiratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo explore the feasibility of use scorpion probe amplification refractory mutation system （sARMS-PCR）to detect Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog（KRAS）and V-rafmurine sarcoma viral oncogene homologB1（BRAF）gene mutations in non-small cell lung cancer（NSCLC）patients．To realize the clinical and pathological feature of KRAS，BRAF genemutations in NSCLC patients，and to provide a theoretical basis for individualized treatment of NSCLC patients．MethodsWe collected 89 cases of tumor formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens（FFPE）in NSCLC patients，then used DNA isolation kit to extract DNA，and used sARMS to test KRAS and BRAF genemutation．Resu lts①We found KRASmutations in 21 patients（21／89），themutation rate was23．6%；the KRASgenemutations included seven kinds of hot spotsmutations，in which 6 were located at codon 12 and 13；the G12D and G12V site mutation and the G12C and G12C were detected from the 6 hot spots respectively；G12Smutantwas not found；②We only found BRAF genemutation in one patient（1／89），the mutation rate was 1．1%．The mutation site was located at V600E，was a women，mucinous adenocarcinoma patient；③KRAS and BRAF gene never co-existed in the same patient．ConclusionUsing sARMS-PCR technology to detect KRAS and BRAF gene mutations is feasible in NSCLC patients．There is no significant correlation with age，smoking history，pathological type in KRASand BRAF genemutations in NSCLC patients．KRASgenemutation is related to gender，more common in women than in men（P＜0．05）；KRAS and BRAF gene never coexist in the same patient．

Key wordsNSCLC；KRAS；BRAF；sARMS

中圖分類號R 734．2

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1669-05

基金項目：安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學科研課題計劃（編號：13ZC001）；安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042216）

作者單位：安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院1呼吸內科、2中心實驗室，合肥230001

作者簡介：邵璐，女，碩士研究生；