博慶麗，阮　亮，胡安拉，李　李，楊　懿，趙奇紅

人源性肝癌異種移植動(dòng)物模型的建立及CD90、ALDH1表達(dá)鑒定

博慶麗1，阮亮1，胡安拉1，李李1，楊懿2，趙奇紅1

摘要從新鮮的人肝癌標(biāo)本上切除腫瘤組織，移植于裸鼠皮下，建立原代移植瘤并連續(xù)傳代3次，觀察移植瘤的成瘤潛伏期、成瘤率、腫瘤體積、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移情況。通過(guò)HE染色，與臨床標(biāo)本進(jìn)行組織病理學(xué)比較，利用免疫組化方法比較腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和乙醛脫氫酶1（ALDH1）在臨床和動(dòng)物模型組織中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示動(dòng)物模型腫瘤組織和臨床腫瘤組織結(jié)構(gòu)類似；CD90、ALDH1表達(dá)一致。建立人源性肝癌移植動(dòng)物模型，其組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，某些特定蛋白表達(dá)一致，可成為肝癌基礎(chǔ)研究的重要工具。

關(guān)鍵詞肝癌；人源性組織異種移植；動(dòng)物模型

2015-06-29接收

醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，合肥230032

趙奇紅，男，講師，責(zé)任作者，E-mail：qihong＠ahmu．edu．cn

目前，手術(shù)切除及肝臟移植是肝癌治療的首要選擇，然而肝癌發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者確診時(shí)已失去手術(shù)最佳時(shí)機(jī)，病死率居高不下。因此，有必要建立與人類臨床肝癌特征相似的人源性腫瘤動(dòng)物模型，以加快抗肝癌藥物的研發(fā)和治療方案的制定，促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。該研究利用裸鼠作為人原發(fā)性肝癌組織異種移植的宿主，建立多例能傳代和復(fù)蘇的并能保持肝癌臨床組織特征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，即人源性腫瘤組織異種移植模型（patient derived tumor xenograftmodel，PDX模型），并對(duì)這些模型的組織結(jié)構(gòu)，某些特定蛋白表達(dá)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB／c雌性裸鼠225只，SPF級(jí)，4～6周齡，（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房（25±2）℃，40%～70%濕度，12 h∶12 h晝夜交替，自由飲食。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d以上。由于臨床標(biāo)本運(yùn)達(dá)時(shí)間不一，購(gòu)買(mǎi)小鼠需要有周齡梯度。接種開(kāi)始于6周齡小鼠。

1．2試劑與耗材Hank′s平衡液（HBSS）購(gòu)自Gibco公司（貨號(hào)：14170）。Matrigel購(gòu)自Corning公司（貨號(hào)：354234）。一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自Greiner bio-one公司（貨號(hào)：664-160）。其余試劑或耗材（紗布、一次性手術(shù)器材等）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1．3腫瘤標(biāo)本來(lái)源與處理肝癌新鮮組織標(biāo)本均收集于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，在患者知情同意的情況下收集臨床手術(shù)的腫瘤標(biāo)本，共30例。術(shù)中切除標(biāo)本之后，立即放入 HBSS中，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。在生物安全柜內(nèi)清除組織表面的壞死物并洗凈血液。腫瘤接種在手術(shù)后4 h內(nèi)完成。

1．4腫瘤移植方法與傳代取臨床手術(shù)切取的新鮮無(wú)菌肝癌組織標(biāo)本，選擇腫瘤活力較好的組織，用組織剪將腫瘤組織剪成約1 mm×2 mm×2 mm的小塊，與Matrigel混好后裝入接種針待用。將小鼠兩側(cè)背部后1／3皮膚酒精消毒備皮，正確姿勢(shì)抓起小鼠，用無(wú)菌組織剪剪開(kāi)0．5 cm長(zhǎng)的切口，將穿刺針由切口處刺入背部皮下，針頭進(jìn)入約2 cm，將腫瘤組織快速注入皮下，將穿刺針旋轉(zhuǎn)拔出，用酒精棉簽將滲血處理干凈，以防止殘留血液引起老鼠噬咬。對(duì)側(cè)做同樣處理，每例標(biāo)本分別接種5只小鼠，術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)。每周測(cè)量動(dòng)物體重2次，當(dāng)成瘤后，每周測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和寬徑2次，并計(jì)算相對(duì)腫瘤的體積（相對(duì)腫瘤體積＝0．52×長(zhǎng)徑×短徑2）。當(dāng)G0代腫瘤生長(zhǎng)至500 mm3時(shí)進(jìn)行體內(nèi)傳代（記錄G1），隨后傳代分別記為G2、G3代等。

1．5模型監(jiān)測(cè)指標(biāo)①每天觀察小鼠的背部愈合情況、毛色、精神狀態(tài)、活動(dòng)力、飲食等。②觀察并記錄局部皮下移植瘤的成瘤潛伏期，以接種腫瘤組織至皮下捫及黃豆大小微結(jié)節(jié)為成瘤潛伏期。③觀察并記錄小鼠的成瘤率、存活率及死亡率。④處死小鼠后取出移植瘤，觀察移植瘤外觀，將患者腫瘤標(biāo)本及每代移植瘤分別做常規(guī)病理切片蘇木精-伊紅染色（HE染色），觀察腫瘤的組織形態(tài)學(xué)特征。⑤通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)患者腫瘤標(biāo)本與移植瘤中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和乙醛脫氫酶1 （aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）的表達(dá)變化。

2　結(jié)果

2．1小鼠生長(zhǎng)情況手術(shù)后第2天，精神狀態(tài)恢復(fù)良好，活動(dòng)力較好，飲食正常，手術(shù)后14 d，背部皮膚愈合，毛色正常。

2．2小鼠成瘤潛伏期及荷瘤鼠生長(zhǎng)情況肝癌臨床標(biāo)本移植后4周左右于接種部位可捫及黃豆粒大小，可在皮下移動(dòng)，質(zhì)地稍硬的實(shí)體腫塊，隨后腫瘤結(jié)節(jié)逐漸增大，6周左右可看到突出于皮膚的腫塊，隨著腫瘤的不斷增大，小鼠出現(xiàn)不同程度的消瘦、弓背等情況，見(jiàn)圖1。移植瘤連續(xù)傳代后，成瘤潛伏期由4周逐漸穩(wěn)定在3～4周。

2．3小鼠成瘤率和腫瘤生長(zhǎng)速度患者肝癌標(biāo)本進(jìn)行裸鼠的原代移植，每例標(biāo)本移植5只，共150只。其中15例臨床標(biāo)本移植成功，原代移植成瘤率為50%。G1代移植15例，G2代移植6例。以移植4周以后背部能捫及黃豆粒大小腫塊認(rèn)為腫瘤成瘤，腫瘤生長(zhǎng)后無(wú)自然消退情況。除了接種過(guò)程導(dǎo)致某些腫瘤形狀極為不規(guī)則而剔除外，其余腫瘤生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

2．4患者標(biāo)本及移植瘤組織病理學(xué)檢查待荷瘤鼠腫瘤長(zhǎng)至足夠大，或出現(xiàn)明顯消瘦和倒毛現(xiàn)象，將小鼠頸椎脫臼處死，取出移植瘤，可見(jiàn)移植瘤表面光滑，為圓形或類圓形實(shí)體瘤，質(zhì)地稍硬。其他臟器表面無(wú)轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)，亦無(wú)其他組織或器官浸潤(rùn)現(xiàn)象。將患者標(biāo)本及每代移植瘤做病理切片，HE染色，400倍光鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)移植瘤組織狀態(tài)（圖3中B、C、E、F圖）與臨床患者肝癌組織（圖3中A、D圖）形態(tài)特點(diǎn)基本相同，具體表現(xiàn)有：肝臟正常的組織結(jié)構(gòu)消失，癌細(xì)胞呈圓形、橢圓形、不規(guī)則形等形態(tài)大小不一，細(xì)胞分界模糊，癌細(xì)胞排列松散；核仁較大，染色質(zhì)濃染，胞質(zhì)所占比例較小，可以見(jiàn)到核分裂相。見(jiàn)圖3。

2.5患者標(biāo)本及移植瘤中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和ALDH1的表達(dá)臨床標(biāo)本和移植瘤切片的免疫組化結(jié)果顯示，患者的臨床標(biāo)本（圖4中A、D圖）和動(dòng)物移植瘤（圖4中B、C、E、F圖）中的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD90表達(dá)一致，主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，胞質(zhì)中很少或不表達(dá)，見(jiàn)圖4；ALDH1在這兩種來(lái)源的組織細(xì)胞膜和胞質(zhì)中均有表達(dá)。其結(jié)果和患者腫瘤的臨床標(biāo)本基本一致，見(jiàn)圖5。

3　討論

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，起病隱匿，病程較短，病死率較高。因此建立良好的肝癌動(dòng)物模型是進(jìn)行醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究的重要手段和平臺(tái)，對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制、診斷與治療研究有很重要的意義［1］。

PDX模型是將患者的新鮮腫瘤組織處理后移植到免疫缺陷或裸鼠上，依靠小鼠提供的微環(huán)境進(jìn)行生長(zhǎng)，異種移植的模型可能是最接近目前人類癌癥特點(diǎn)的［2］。與人癌細(xì)胞系建立的動(dòng)物模型相比，PDX模型減少了體外處理過(guò)程，能更好地保持患者臨床腫瘤組織的原有生物學(xué)特性和組織學(xué)特征，并且PDX模型取材于不同的患者，可以保留了患者腫瘤的異質(zhì)性，不僅可以檢測(cè)治療功效，也是符合癌癥生物學(xué)治療基本原則的一種工具和手段［3］，還可以幫助測(cè)試新的抗腫瘤藥物的療效［4］，同時(shí)也為腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究提供了新的方法，為一對(duì)一的個(gè)體化抗癌治療提供了可能。在本研究所建的模型中，PDX模型的移植瘤與人來(lái)源的腫瘤標(biāo)本有一致的組織特征，可見(jiàn)肝臟正常的組織結(jié)構(gòu)消失，癌細(xì)胞呈圓形、橢圓形、不規(guī)則形等形態(tài)，大小不一，細(xì)胞分界模糊不清，癌細(xì)胞排列松散；核仁較大，染色質(zhì)濃染，胞質(zhì)所占比例較小等。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和ALDH1檢測(cè)顯示在移植瘤與患者腫瘤的臨床標(biāo)本表達(dá)陽(yáng)性，一方面說(shuō)明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起作用，亦提示該模型保留了原癌的生化特點(diǎn)。這與其他研究人員對(duì)不同腫瘤的研究相一致，如乳腺癌、腹水型卵巢癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、食管癌等也同樣證實(shí)了PDX模型保持了原代腫瘤的生物學(xué)特性，是一個(gè)穩(wěn)定、可靠的癌癥研究模型，為研究癌癥提供了很好的動(dòng)物模型［2，5-8］。

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Establishment of patient-derived liver cancer xenograftmodels and assessment of the expression of CD90 and ALDH1

Bo Qingli，Ruan Liang，Hu Anla，et al
（School of Public Health，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractFresh specimens excised from the patientswith liver cancer were transplanted into nudemice subcutaneously to establish the patient-derived liver cancer xenograftmodels，which could be passaged 3 times continuously．The tumor latency，take rate，tumor growth，invasion and metastasis of thesemodelswere recorded meanwhile．Histopathological structure was compared by HE staining in the clinical samples and the passaged samples．The expression status of cancer stem cellmarkers CD90 and aldehyde dehydrogenase 1（ALDH1）were checked in these samples using immunohistochemicalmethods．Similar histopathological structure was observed in those samples，and so did the expression of CD90 and ALDH1．Thesemodels are valuable for the basic researches in liver cancer，which had the characters of stable histopathological structure and stable expression of some certain proteins．

Key wordslive cancer；patient-derived xenograft；animalmodel

中圖分類號(hào)R 965．1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1698-04

基金項(xiàng)目：安徽醫(yī)科大學(xué)校級(jí)科學(xué)研究基金（編號(hào)：2012xkj015）；安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研資助項(xiàng)目（編號(hào)：XJ201111）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金（編號(hào)：2012SQRL072）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題（新教師類）（編號(hào)：20123420120012）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生系、2基礎(chǔ)

作者簡(jiǎn)介：博慶麗，女，講師；