蔣秀敏，劉雨生，許　波

m iR-483-5p通過(guò)靶基因ERK1調(diào)控人類(lèi)顆粒細(xì)胞增殖凋亡平衡

蔣秀敏，劉雨生，許波

摘要目的證明miR-483-5p及其靶基因ERK1參與調(diào)控人類(lèi)顆粒細(xì)胞增殖凋亡平衡。方法①體外培養(yǎng)人正常顆粒細(xì)胞，調(diào)控其miR-483-5p超表達(dá)，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及Western blot法檢測(cè)ERK1的mRNA及蛋白表達(dá)情況；將包含野生型或突變型的ERK1 mRNA 3′UTR的DNA片段克隆在熒光素酶標(biāo)記的質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimics、controlmiRmimics和野生型、突變型重組質(zhì)粒，檢測(cè)其顆粒細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性；②將miR-483-5p mimics及ERK1 siRNAs單獨(dú)及共同轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，MTT法及TUNEL法分別檢測(cè)三種情況下卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡情況。結(jié)果①miR-483-5p超表達(dá)后，ERK1基因及蛋白表達(dá)均下降；與control-Wt（野生型）轉(zhuǎn)染組相比，miR-483-Wt組的熒光素酶活性顯著降低；miR-483-Mut（突變型）與control-Mut轉(zhuǎn)染組間熒光素酶活性的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②miR-483-5p mimics與ERK1 siRNAs單獨(dú)及共同轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，三種轉(zhuǎn)染條件下顆粒細(xì)胞增殖均顯著受抑制、凋亡率顯著升高，且三種作用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論miR-483-5p通過(guò)直接與靶基因ERK1結(jié)合，參與調(diào)控人類(lèi)顆粒細(xì)胞增殖凋亡平衡。

關(guān)鍵詞miR-483-5p；ERK1／2-MAPK通路；顆粒細(xì)胞；增殖凋亡平衡

2015-07-27接收

劉雨生，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shengzhizhongxin＠126．com

微小RNA（microRNA，miRNA）作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，參與了包括分化、增殖、凋亡等過(guò)程，進(jìn)而參與包括胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、壓力應(yīng)答等幾乎所有的生物學(xué)進(jìn)程［1］。miRNA廣泛參與卵泡發(fā)育成熟、受精、著床及早期胚胎發(fā)育等過(guò)程，維持女性正常生育功能［2-4］。顆粒細(xì)胞是卵巢中十分重要的細(xì)胞，參與了包括原始卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)、增殖、分化、閉鎖、排卵等全部的卵巢生理過(guò)程，與卵巢疾病的發(fā)生密切相關(guān)［4］。如果顆粒細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，將引起卵泡內(nèi)局部激素環(huán)境變化，進(jìn)而干擾正常卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵巢病理性改變，如多囊卵巢綜合癥（polycystic ovarian syndrome，PCOS）的發(fā)生等［5-6］。因此顆粒細(xì)胞的增殖-凋亡平衡對(duì)生殖功能產(chǎn)生重要的影響。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族中關(guān)鍵通路ERK1／2-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、分化中的作用已引起了廣泛關(guān)注。研究［1］表明，ERK1／2-MAPK通路參與維持卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞增殖-凋亡的平衡。另有研究［7］表明miR-483-5p在腫瘤中的作用較多，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示其與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期變化及其遷移、侵襲能力等生物學(xué)行為有關(guān)；有研究者證明miR-483-5p通過(guò)直接調(diào)控靶基因血清反應(yīng)因子（serum response factor，SRF）發(fā)揮抑制血管形成的作用［8］。筆者在前期研究［2］中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)比較PCOS和正常人群顆粒細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的miRNA及其下游通路，發(fā)現(xiàn)miR-483-5p在PCOS顆粒細(xì)胞中表達(dá)明顯升高且ERK1的表達(dá)明顯下降，并證實(shí)顆粒細(xì)胞內(nèi)ERK1的表達(dá)變化受到了 miR-483-5p的調(diào)控。該研究通過(guò)單獨(dú)、共同轉(zhuǎn)染miR-483-5p及siRNAs顆粒細(xì)胞后，觀察顆粒細(xì)胞的增殖凋亡情況。

1　材料與方法

1．1研究對(duì)象卵巢顆粒細(xì)胞均來(lái)自于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，選取的是因男方因素行自然周期單精子卵胞漿內(nèi)注射與胚胎移植（Intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer，ICSI-ET）而助孕的女方顆粒細(xì)胞。按照安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定，入選患者簽署知情同意書(shū)。

自然周期選取標(biāo)準(zhǔn)：①所有研究對(duì)象無(wú)全身及其它婦科、內(nèi)分泌等疾??；②月經(jīng)規(guī)律；③超聲檢查無(wú)多囊卵巢改變；④基礎(chǔ)內(nèi)分泌無(wú)異常；⑤排除糖尿病家族史，空腹血糖水平正常；⑥男方均為重度少弱精癥或梗阻性無(wú)精癥；⑦男女雙方無(wú)染色體異常；⑧研究對(duì)象的年齡均在25～33歲。

1．2主要試劑RPMI-1640（美國(guó)Gibco公司）；miR-483-5pmimics、control-miRmimics（Gene Pharma 公 司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；HMA F10（英國(guó) Sigma公司）；SYBR premix Ex TaqTMIIKit（TaKaRa公司）；硝酸纖維素膜（Amersham Biosciences）；抗-ERK1抗體、β-actin抗體（Abcam公司）；羊抗兔IgG抗體（Promega公司）；MTT溶液、DMSO、TUNEL反應(yīng)混合液（Roche公司）。

1．3方法

1．3．1顆粒細(xì)胞的分離及培養(yǎng)自然周期陰道穿刺取卵；獲取的含有成熟卵母細(xì)胞的卵丘復(fù)合物經(jīng)機(jī)械切割法分離外圍顆粒細(xì)胞。用含有20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)原代培養(yǎng)24 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．3．2miRNA及siRNAs轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞將miR-483-5pmimics及ERK1 siRNAs單獨(dú)及共同轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞。將miR-483-5p mimics和 controlmiR mimics分別加入無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基EP管中，均勻混合，緩慢加入含2μl LipofectamineTM2000 50μl無(wú)血清無(wú)雙抗HMA F10培養(yǎng)基中，反復(fù)顛倒混勻，在室溫下以使脂質(zhì)體與類(lèi)似物或?qū)φ招纬蓮?fù)合物，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimics組標(biāo)記為轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染controlmiR mimics組標(biāo)記為對(duì)照組。miR-483-5p mimics序列為：5′-AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG-3′；control-miRmimics序列為：5′-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA-3′。

通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組中的靶基因ERK1 mRNA表達(dá)量，通過(guò)Western blot分析兩組在轉(zhuǎn)染后ERK1蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)兩組的顆粒細(xì)胞增殖率及凋亡率。轉(zhuǎn)染siRNAs與轉(zhuǎn)染miRNA步驟一樣。

1．3．3熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建和熒光素酶活性檢測(cè)將miRNA的靶基因mRNA的3′UTR克隆到熒光素酶報(bào)告載體上，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)能夠顯示miRNA是否直接結(jié)合到這個(gè)UTR上。由上海康成生物工程有限公司完成野生型和突變型ERK1 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵丘顆粒細(xì)胞，參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行，將 miR-483-5p mimics和control-miR mimics及野生型和突變型ERK1 mRNA 3′UTR共轉(zhuǎn)染到顆粒細(xì)胞中。按雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法進(jìn)行，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加入細(xì)胞裂解液和螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)劑100μl，混勻15 min后，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性（Ff），再加入海腎素?zé)晒馑孛笝z測(cè)試劑100μl，測(cè)量海腎素?zé)晒馑孛富钚裕≧n）。熒光素酶活性（C）＝Rn／Ff。

1．3．4miRNA及 mRNA表達(dá)的檢測(cè)分別檢測(cè)三種情況下ERK1 mRNA表達(dá)量。提取卵丘顆粒細(xì)胞總RNA后，首先利用Reverse Transcription Kit對(duì)總RNA內(nèi)待檢測(cè)的miR-483-5p進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后利用SYBR premix Ex TaqTMIIKit檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平，所有步驟均嚴(yán)格按照操作手冊(cè)進(jìn)行。其中snRNAU6作為miRNA表達(dá)量檢測(cè)時(shí)的內(nèi)參，GAPDH作為mRNA的內(nèi)參。每個(gè)樣品的PCR反應(yīng)平行重復(fù)3個(gè)孔，所有RT-PCR實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。根據(jù)待測(cè)基因和內(nèi)參的循環(huán)數(shù)CT值，按照公式：相對(duì)值＝2-ΔΔCT計(jì)算出樣本待測(cè)基因相對(duì)于內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。

1．3．5Western blot分析顆粒細(xì)胞中加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取上清總蛋白。蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 120V電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶／TBST封閉1 h，然后4℃冰箱中封閉過(guò)夜。分別加入抗-ERK1抗體及作為內(nèi)參的β-actin抗體。然后加入二抗，即用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，孵育2 h，用TBST洗膜30 min。將洗好的硝酸纖維素膜放入透明的薄膜中，并在其上加入顯色液后，待反應(yīng)一段時(shí)間后，觀察顯色效果。出現(xiàn)合適亮度條帶后用定影液對(duì)其進(jìn)行定影，再清洗后晾干，最后掃描或者拍照保存。

1．3．6MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力選取顆粒細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)／ml，然后接種至96孔板，每孔200μl，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每孔加入MTT溶液20μl繼續(xù)孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加 150μl的DMSO，然后將 96孔板放在搖床上勻速搖晃10 min，分別在24、48、72 h檢測(cè)492 nm處各孔吸光度，計(jì)算其細(xì)胞增殖率。

1．3．7TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡顆粒細(xì)胞接種在預(yù)置有滅菌玻片的24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)控制密度在5×104／m l，用含10%熱滅活胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，將爬片擦干后放置于濕盒上，用TBS1～100新鮮稀釋的蛋白酶K室溫下處理30 min，處理組加入TUNEL反應(yīng)混合液（50μl TdT和450μl熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻），以50μl／片的量滴入爬片；而陰性對(duì)照組滴入50μl熒光素標(biāo)記的dUTP；陽(yáng)性對(duì)照組滴入50μl DNasel緩沖液，用甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。結(jié)果判定：每個(gè)樣本隨機(jī)觀察20個(gè)視野，分別對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算調(diào)亡率。分別在轉(zhuǎn)染后的24、48、72 h檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡率。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1證實(shí)m iRNA-483-5p調(diào)控 ERK 1的表達(dá)通過(guò)miRNA-483-5p mimics轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，檢測(cè)miRNA-483-5p超表達(dá)后的ERK1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。PCR和Western blot結(jié)果顯示，miRNA-483-5p轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后ERK1 mRNA和蛋白表達(dá)均下降，見(jiàn)圖1A、1B。進(jìn)一步將包含野生型或突變型的ERK1 mRNA 3′UTR的DNA片段克隆在熒光素酶標(biāo)記的質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染了miR-483-5p mimics、controlmiRmimics和野生型／突變型重組質(zhì)粒，檢測(cè)其顆粒細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性，與control-Wt轉(zhuǎn)染組相比，miR-483-W t組的熒光素酶活性顯著降低；miR-483-Mut與control-Mut轉(zhuǎn)染組間熒光素酶活性的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1C、1D。

2.2過(guò)表達(dá) m iR-483-5p及 ERK1 siRNAs對(duì)顆粒細(xì)胞體外增殖影響在顆粒細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-483-5pmimics及ERK1 siRNAs的24、48、72 h，MTT法分別檢測(cè)不同時(shí)間細(xì)胞的增殖率，與對(duì)照組相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimics及ERK1 siRNAs均明顯抑制顆粒細(xì)胞的增殖率（P＜0．05），見(jiàn)圖2A、2B，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)其抑制越明顯。

2.3TUNEL染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染m iR-483-5p m im ics及ERK1 siRNAs后顆粒細(xì)胞的凋亡情況與對(duì)照組相比，兩組的凋亡率明顯升高，同時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)其凋亡率越高，見(jiàn)圖3、表1。

表1　轉(zhuǎn)染m iR-483-5p m im ics及ERK 1 siRNAs后顆粒細(xì)胞的凋亡率（%）

2.4單獨(dú)及共同轉(zhuǎn)染m iR-483-5p與ERK1 siRNAs對(duì)顆粒細(xì)胞增殖凋亡平衡的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miR-483-5p、轉(zhuǎn)染ERK1 siRNAs及共同轉(zhuǎn)染miR-483-5p和ERK1 siR-NAs均明顯抑制顆粒細(xì)胞的增殖率，且三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝31．76，P＜0．05），圖4A；TUNEL法檢測(cè)三組顆粒細(xì)胞的凋亡率均明顯升高，見(jiàn)圖4B，且三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝315．58，P＜0．05）。

3　討論

miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼小RNA（18～25個(gè)核苷酸）通過(guò)降解靶mRNA或抑制其翻譯，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。在前期研究中，通過(guò)繪制的人類(lèi)卵丘顆粒細(xì)胞差異表達(dá)miRNA圖譜發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞內(nèi)miRNA通過(guò)調(diào)控能量／氨基酸代謝、免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)控、細(xì)胞分化等多個(gè)通路，參與了卵母細(xì)胞和卵泡的發(fā)生與發(fā)育［4］。進(jìn)一步通過(guò)分析PCOS患者和正常對(duì)照人群顆粒細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的miRNA及下游通路，發(fā)現(xiàn)miR-483-5p在PCOS顆粒細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，且通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因ERK1 （MAPK3）表達(dá)參與下游MAPK信號(hào)通路的調(diào)控［2］。本研究結(jié)果表明miR-483-5p能下調(diào)ERK1在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合miRNA-mRNA結(jié)合位點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確認(rèn)miR-483-5p對(duì)于靶基因ERK1表達(dá)的抑制是通過(guò)直接結(jié)合而抑制的。

顆粒細(xì)胞具有分泌性腺激素維持卵巢功能的能力，在卵泡的正常發(fā)育中起著重要的作用。在需要進(jìn)行輔助生殖的人群中發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞凋亡直接影響IVF-ET的結(jié)局與妊娠成功率［9］。這些證據(jù)表明顆粒細(xì)胞的增殖-凋亡平衡對(duì)于卵巢內(nèi)的激素微環(huán)境、卵子和卵子的發(fā)育及后期胚胎的形成和生長(zhǎng)都具有極其重要的影響。Amhr2-cre-Dicer1條件性敲除小鼠模型的研究［10］表明miRNA在卵巢體細(xì)胞中的缺失會(huì)導(dǎo)致原始卵泡形成增多、早期卵泡激活加速以及閉鎖卵泡增多等多種表型，與卵泡發(fā)育相關(guān)基因等也同時(shí)發(fā)生了顯著性的變化。本研究中通過(guò)人為調(diào)控對(duì)miR-483-5p進(jìn)行超表達(dá)，結(jié)果表明超表達(dá)后顆粒細(xì)胞增殖受抑制，凋亡率增加。這些結(jié)果表明卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)的miRNA對(duì)于卵母細(xì)胞、卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育有著不可替代的調(diào)控作用［1-4］。

ERK1／2-MAPK通路是細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核的重要傳遞者，通過(guò)影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵過(guò)程［11-12］。顆粒細(xì)胞ERK1／2-MAPK通路在促卵泡刺激素（FSH）及生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且ERK1／2-MAPK通路的持續(xù)激活可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生［11-12］。利用ERK1／2特異性抑制劑U0126抑制ERK1／2的活性會(huì)抑制FSH對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，并且抑制顆粒細(xì)胞內(nèi)激素的正常分泌［13］。有研究［14］顯示，卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的異常狀態(tài)與MAPK通路的失調(diào)直接相關(guān)。在顆粒細(xì)胞內(nèi)，ERK1／2的激活導(dǎo)致下游絲氨酸／蘇氨酸激酶P90RSK蛋白、轉(zhuǎn)錄因子-3 （Stat3）等磷酸化而激活轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。同時(shí)，活化后的ERK1可以促進(jìn)細(xì)胞周期素D1（CylinD1）與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-4 （CDK4）的結(jié)合進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期［1］。這些證據(jù)表明，ERK1／2-MAPK通路參與維持卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞增殖-凋亡的平衡。前期研究［2］顯示，PCOS患者顆粒細(xì)胞內(nèi)ERK1的表達(dá)和對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯的下降，并證實(shí)顆粒細(xì)胞內(nèi) ERK1的表達(dá)變化受到了miR-483-5p的調(diào)控。與之相對(duì)應(yīng)的，本研究顯示miR-483-5p mimics轉(zhuǎn)染和ERK1 siRNAs單獨(dú)及兩者共同處理顆粒細(xì)胞后，檢測(cè)ERK1／2-MAPK通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性，結(jié)果顯示顆粒細(xì)胞的增殖能力明顯下降，而凋亡比例明顯升高，且不論單獨(dú)及共同處理其作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明miR-483-5p下調(diào)ERK1表達(dá)參與顆粒細(xì)胞增殖凋亡平衡與ERK1 siRNAs的轉(zhuǎn)染抑制ERK1表達(dá)參與顆粒細(xì)胞增殖凋亡機(jī)制在一條通路上。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-483-5p直接調(diào)控ERK1，參與調(diào)控卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡等關(guān)鍵過(guò)程。

維持顆粒細(xì)胞增殖-凋亡平衡是正常卵泡發(fā)育的必要條件，該平衡的失調(diào)對(duì)于卵巢內(nèi)的激素微環(huán)境、卵子和卵子的發(fā)育及后期胚胎的形成和生長(zhǎng)都具有極其重要的影響。同時(shí)顆粒細(xì)胞增殖與凋亡平衡的維持是一個(gè)多因素調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)構(gòu)成了復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。平衡一旦被打破，卵巢功能就會(huì)出現(xiàn)異常，不但會(huì)導(dǎo)致生殖功能異常，同時(shí)還會(huì)引起代謝失調(diào)等其他并發(fā)癥。因此，了解miR-483-5p及其下游靶基因和通路在維持顆粒細(xì)胞增殖-凋亡平衡中的作用，將為研究卵巢、卵泡、卵子的發(fā)育和調(diào)控以及相關(guān)疾病研究提供新的思路和研究手段，有助于了解miRNA在雌性生殖細(xì)胞發(fā)育及相關(guān)生殖過(guò)程中的作用。

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Characterization ofm iRNA-483-5p and targeted gene ERK1 in the regulation of proliferation-apoptosis balance of human granulosa cells

Jiang Xiumin，Liu Yusheng，Xu bo
（Reproductive Medicine Center，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo demonstrate thatmiR-483-5p and its targeted gene ERK1 involved in the regulation of proliferation and apoptosis of human granulosa cells．Methods①The ERK1 mRNA and protein level expression were detected by PCR and Western blot aftermiR-483-5p overexpression in vitro normal human granular cells．Detected the relative luciferase density after cotransfectingmiR-483-5p mimics and its control respectively with wild or mutant ERK1 mRNA 3｀UTR cloned luciferase report vector in granular cells．②Granular cells proliferation and apoptosis were detected by MTT and TUNEL after transfectingmiR-483-5p mimics or ERK1 siRNAs alone or simultaneously．Results①I(mǎi)t showed thatboth ERK1 mRNA and protein in granular cellsweremarkedly downregulated after the transfection ofmiR-483-5pmimics．A significant relative luciferase activity decrease were detected in the granular cells co-transfected with ERK1 wild and miR-483-5p mimics comparison with the controlmimics，but not in the cells co-transfected with the ERK1 mutant andmiR-483-5pmimics．②WhenmiR-483-5p mimicsand ERK1 siRNAs were alone or co-transfected into granular cells，the proliferation was inhibited while apoptosis trend was monitored to be promoted in all cases．No obvious statistic difference was shown between each other．Conclusion MiR-483-5p is involved in the regulation of the proliferation and apoptosis of human granulosa cells by directly binding to the target gene ERK1．

Key wordsmiR-483-5p；ERK1／2-MAPK pathway；granular cells；proliferation-apoptosis balance

中圖分類(lèi)號(hào)R 715．5；R 329．5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1639-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81370757）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖中心，合肥230001

作者簡(jiǎn)介：蔣秀敏，女，碩士研究生；