陳培　杰，李　俊，黃　　成，孟曉　明，蔡雙朋

PICK 1在肝纖維化中的表達(dá)變化及功能研究

陳培杰1，2，3，李俊1，2，3，黃成1，2，3，孟曉明1，2，3，蔡雙朋1，2，3

摘要目的研究蛋白激酶C結(jié)合蛋白1（PICK1）在小鼠肝纖維及活化的肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)變化，并探討其對人肝星狀細(xì)胞株（LX-2）活化的影響。方法建立四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，觀察PICK1在肝纖維化過程中的表達(dá)變化；轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）刺激LX-2活化，Western blot測定PICK1的蛋白表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染PICK1過表達(dá)質(zhì)粒至LX-2中，再以TGF-β1誘導(dǎo)活化，Western blot檢測PICK1、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原（Col1a1）和Smad2、3及其磷酸化水平的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果正常組小鼠肝臟中PICK1表達(dá)較高，隨著肝纖維化的加重，PICK1的表達(dá)逐漸遞減。TGF-β1誘導(dǎo)活化的LX-2細(xì)胞中PICK1表達(dá)降低。轉(zhuǎn)染PICK1過表達(dá)質(zhì)粒后，TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、Colla1的表達(dá)明顯減少，且Smad2、3磷酸化水平顯著下降。結(jié)論P(yáng)ICK1在纖維化肝組織及活化的HSC中表達(dá)下調(diào)。過表達(dá)PICK1可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2活化，可能是通過抑制TGF-β／Smad通路而發(fā)揮作用，為肝纖維化的防治研究提供了新的思路和靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞PICK1；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞

2015-06-29接收

李俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lijun＠ahmu．edu．cn

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由多種病因引起的肝臟慢性損傷修復(fù)反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的沉積為特征［1-2］。研究［2］顯示肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖并活化為肌成纖維細(xì)胞是HF發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，HSC可以被多種細(xì)胞因子激活，其中以轉(zhuǎn)化生長因子β1 （transforming growth factorβ1，TGF-β1）為代表。

蛋白激酶C結(jié)合蛋白1（protein interacting with Ca-kinase-1，PICK1）在細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生理過程中發(fā)揮重要作用［3-4］，但其在HF中的表達(dá)和功能研究尚沒有報道。研究［5］表明PICK1可以負(fù)調(diào)控TGF-β通路，使細(xì)胞對TGF-β1的反應(yīng)性增強(qiáng)，提示PICK1可能參與了肝纖維化的發(fā)展。因此該研究觀察PICK1在肝纖維化過程中的表達(dá)情況，并轉(zhuǎn)染PICK1質(zhì)粒，檢測α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和I型膠原（collagen type I，Col1α1）的表達(dá)水平，探討PICK1對HSC活化的作用及作用機(jī)制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動物40只雄性C57BL／6J小鼠，普通級，6～8周齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1．1．2細(xì)胞株人肝星狀細(xì)胞株（LX-2）由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院徐列明教授饋贈。

1．1．3主要材料與試劑四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）（上海汕頭西隴化工廠）；重組人轉(zhuǎn)化生長因子 β1（TGF-β1）（英國PeproTech公司）；DMEM培養(yǎng)液、OPTI-MEM、胎牛血清、胰酶、青-鏈霉素溶液（美國Gibco公司）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；人PICK1質(zhì)粒（上海吉凱公司）；Rabbit pAb anti-PICK1抗體（美國Abcam公司）；Rabbit anti-Col1α1（北京博奧森公司）；Mouse anti-β-actin（北京中杉金橋公司）；Mouse anti-α-SMA、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H＋L）、山羊抗兔IgG（H＋L）（武漢博士德生物工程有限公司）；化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1．1．4儀器NAPCO-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Sigam3-16K高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；冷凍離心機(jī)TGL-18R（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；Western blot設(shè)備（美國Biorad公司）。

1．2方法

1．2．1動物分組與肝纖維模型的建立小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組、模型4周組、模型6周組、模型8周組，每組10只。模型組每只小鼠按0．02 ml／g體重腹腔注射10%CCl4（按體積比CCl4∶橄欖油＝1∶9），每周2次，持續(xù)4周，之后每周1次。分別于第4、6、8周處死動物。正常對照組小鼠在相同的時間點(diǎn)腹腔注射同等體積的橄欖油。在末次注射24 h后，引頸處死動物，立即摘取部分肝臟-80℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣∫徊糠纸M織于10%甲醛溶液中固定，用于組織病理學(xué)觀察。

1．2．2病理學(xué)檢查取相同部位小鼠肝臟右葉組織，石蠟包埋，切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson膠原纖維染色，觀察肝臟組織的病理學(xué)改變和膠原纖維增生情況，分析和評價CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷和纖維化程度。

1．2．3LX-2細(xì)胞培養(yǎng)和傳代LX-2細(xì)胞使用含有10%胎牛血清及100 U／ml青霉素和100 mg／ml鏈霉素的高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)到約80%時，用0．25%胰蛋白酶消化傳代或按所需濃度接種培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板。

1．2．4LX-2的誘導(dǎo)活化取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁，然后添加終濃度為0、2、5、10 ng／ml的TGF-β1，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞活化。

1．2．5轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞生長融合大約80%時，用Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋LipofectamineTM2000和質(zhì)粒至所需濃度，室溫靜置5 min。將稀釋后的質(zhì)粒與LipofectamineTM2000小心吹打混勻，室溫再靜置20min以形成穩(wěn)定的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物。隨后棄去舊培養(yǎng)液，將上述含有復(fù)合物的培養(yǎng)液加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后更換完全培養(yǎng)基DMEM，并加入TGF-β1（5 ng／m l），繼續(xù)作用24 h。實(shí)驗(yàn)分組為正常組：不做任何處理；模型組：以等體積的Opti-MEM代替轉(zhuǎn)染液；陰性對照組：轉(zhuǎn)染GV144-control空載質(zhì)粒；PICK1過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染GV144-PICK1質(zhì)粒。

1．2．6Western blot檢測蛋白水平收集肝組織及處理后的細(xì)胞，加入 RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，4℃、12 000 r／min離心30 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量后加入上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后按蛋白分子量大小切膠轉(zhuǎn)膜，以5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h，Tris-HCl-Tween（TBST）洗膜后，分別用相應(yīng)的抗體（1∶500）孵育，次日，膜用TBST清洗后，用與一抗種屬相匹配的的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件掃描并分析蛋白質(zhì)表達(dá)相對含量。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，用One-Way ANOVA檢驗(yàn)各組間差異的顯著性。

2　結(jié)果

2．1小鼠肝纖維化進(jìn)程中肝臟病理學(xué)改變

2．1．1小鼠肝組織大體觀察正常對照組小鼠肝臟表面光滑、柔軟，邊緣銳利，顏色呈紅棕色，可以看見肝組織中有豐富的血管。模型組小鼠肝臟腫脹偏大，質(zhì)地較硬，表面粗糙，且可以看到有中等量到大量的灰黃色的結(jié)節(jié)。

2．1．2肝臟組織學(xué)改變HE染色及Masson染色顯示：正常對照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見病理性改變，只有極少量細(xì)小的藍(lán)色纖維組織，位于血管周圍。CCl4造模4周后肝小葉結(jié)構(gòu)開始紊亂，并伴有脂肪空泡，有少量膠原纖維沉積。造模第6周可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，并伴有大量脂肪空泡，纖維間隔明顯增厚，形成假小葉。造模第8周肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，肝臟出現(xiàn)廣泛的脂肪變性。提示小鼠肝纖維化模型建立成功。見圖1。

2.2PICK1在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化組織中的蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，正常對照組小鼠肝組織PICK1表達(dá)量較高，模型組小鼠肝組織PICK1表達(dá)量較正常對照組明顯降低，并且隨CCl4造模時間的延長及纖維化程度加重，表達(dá)量逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝193．123，P＜0．05）；α-SMA在肝組織中的表達(dá)及變化趨勢與其相反，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝464．929，P＜0．05）。見圖2。

2.3TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞中PICK1蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化后，α-SMA蛋白表達(dá)顯著增加，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝80．04，P＜0．05），但PICK1蛋白較正常對照組表達(dá)則顯著下降（F＝8．932，P＜0．05）。見圖3。

2.4過表達(dá)PICK 1對TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的影響Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 GV144-PICK1質(zhì)粒后，LX-2細(xì)胞內(nèi)PICK1蛋白表達(dá)水平與陰性對照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝14．458，P＜0．05）。與正常組比較，模型組α-SMA蛋白水平明顯升高（F＝57．34，P＜0．01），Col1α1蛋白水平也顯著上升（F＝24．539，P＜0．01），提示TGF-β1成功誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化。而轉(zhuǎn)染GV144-PICK1質(zhì)粒后，α-SMA蛋白水平較陰性對照組顯著下降（F＝57．34，P＜0．01），Col1α1蛋白水平也明顯降低（F＝24．539，P＜0．01）。表明過表達(dá)PICK1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2的活化。見圖4。

2.5過表達(dá)PICK 1對TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞中Sm ad2和Sm ad3磷酸化水平的影響為了進(jìn)一步研究PICK1的作用機(jī)制，筆者進(jìn)一步檢測了PICK1過表達(dá)后，LX-2中Smad2、3及二者的磷酸化水平，Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Smad2蛋白磷酸化水平顯著升高（F＝82．289，P＜0．05），Smad3蛋白磷酸化水平也顯著上升（F＝8．732，P＜0．05）；而轉(zhuǎn)染GV144-PICK1質(zhì)粒后，Smad2蛋白磷酸化水平顯著下降（F＝82．289，P＜0．05），Smad3蛋白磷酸化水平也明顯降低（F＝8．732，P＜0．05）。見圖5。

3　討論

研究［6-7］表明TGF-β1是肝纖維化最重要的始動因子之一，TGF-β1可以促進(jìn)HSC增殖活化及ECM的合成，其主要通過TGF-β／Smad通路發(fā)揮效應(yīng)，因此拮抗TGF-β1對細(xì)胞的作用、抑制TGF-β／Smad通路對于抗肝纖維化研究至關(guān)重要。

研究［5］顯示PICK1能夠負(fù)調(diào)控TGF-β／Smad通路，影響細(xì)胞對TGF-β1的反應(yīng)性。因此，本研究首先建立了小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)PICK1在正常對照組表達(dá)量較高，而隨著肝纖維化程度的加重，PICK1的表達(dá)逐漸降低，與α-SMA表達(dá)趨勢相反，提示PICK1可能參與了肝纖維化的發(fā)展。然后課題組應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)LX-2活化并檢測PICK1的蛋白水平，結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)LX-2活化后，PICK1較正常組明顯降低，這與小鼠纖維化肝組織檢測結(jié)果一致，表明PICK1可能參與了HSC的活化。為進(jìn)一步明確其在HSC中的作用，本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染PICK1質(zhì)粒，觀察PICK1對LX-2活化及膠原分泌的影響，Western blot結(jié)果顯示隨著PICK1表達(dá)水平的增加，α-SMA及Col1α1的蛋白表達(dá)水平較陰性對照組均顯著降低，表明過表達(dá)PICK1可以明顯抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2的活化和膠原的分泌。有研究［5］報道，敲除 PICK1，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞對TGF-β1反應(yīng)會明顯增強(qiáng)，TGF-β1引起的細(xì)胞形態(tài)改變更加顯著、細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，本研究結(jié)果與之一致。另外有研究［4-5］顯示PICK1的表達(dá)情況通常與TGF-β通路蛋白呈明顯負(fù)相關(guān)，過表達(dá)PICK1可明顯抑制TGF-β1的轉(zhuǎn)錄活性及Smad2的磷酸化，并且PICK1可通過抑制TGF-β通路，拮抗TGF-β1對乳腺癌細(xì)胞的效應(yīng)，參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，筆者推測PICK1影響HSC的活化可能與TGF-β／Smad通路有關(guān)，為此課題組檢測了TGF-β／Smad通路蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示過表達(dá)PICK1后，Smad2及Smad3磷酸化水平顯著下降，表明在LX-2中PICK1可以抑制TGF-β／Smad通路，并且這可能是PICK1參與肝纖維化病程的機(jī)制之一。

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The expression and effect of PICK1 in liver fibrosis

Chen Peijie1，2，3，Li Jun1，2，3，Huang Cheng1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，2Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University；3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo explore the expression of protein interactingwith Ca-kinase-1（PICK1）in fibrotic liver of mice and activated hepatic stellate cell，and investigate the effect of PICK1 on the activation of hepatic stellate cell strain（LX-2）．MethodsLiver fibrosismodel in mice was induced by CCl4 and then the PICK1 levelwas detected in fibrotic liver tissue．LX-2 cells were activated by transforming growth factorβ1（TGF-β1），and the protein level of PICK1 was detected by Western blot．After transfected with the plasmid expressing PICK1，LX-2 was stimulated with TGF-β1，the levels ofα-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（Col1a1），Smad2，3 and phosphorylation level of them were determined by Western blot．ResultsPICK1 was highly expressed in normalliver tissues and progressively down-regulated as liver fibrosis progressed．The expression of PICK1 was down-regulated in activated LX-2 induced by TGF-β1．The hepatic stellate cell transfected with PICK1-plasmid showed remarkablely decreased TGF-β1-inducedα-SMA and Col1a1 expression and obviously declined phosphorylation levels of Smad2 and Smad3．ConclusionThe expression of PICK1 decreases in fibrotic livers and activated hepatic stellate cell．Over-expression of PICK1 can suppress the activation of hepatic stellate cell induced by TGF-β1，and probably because of the inhibitory effect on TGF-β／Smad pathway，which provides new ideas and targets for the prevention and treatment of liver fibrosis．

Key wordsPICK1；Liver Fibrosis；hepatic stellate cell

中圖分類號R 322．47；R 329．25；R 575；R 965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1606-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81273526、81473268）；安徽省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：1301042212）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：1308085MH145）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號：20123420120001）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院、2肝病研究所，3安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，合肥230032

作者簡介：陳培杰，女，碩士研究生；