程光存，嚴(yán)中亞，李春生，嚴(yán)　宇，韋曉勇，李建華，湯丹丹，程光明，董桂福，姜　波，蔡　燕

體外和體內(nèi)內(nèi)皮化在膠原包埋羥基磷灰石涂層的人工機(jī)械瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究

程光存，嚴(yán)中亞，李春生，嚴(yán)宇，韋曉勇，李建華，湯丹丹，程光明，董桂福，姜波，蔡燕

摘要目的通過(guò)體外內(nèi)皮化和體內(nèi)內(nèi)皮化，探討沉積膠原包埋羥基磷灰石（HA）涂層人工機(jī)械瓣膜的可行性及其在人工機(jī)械瓣膜支架體內(nèi)的再細(xì)胞化能力。方法制備犬血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）懸液，接種在膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜材料上，置培養(yǎng)箱內(nèi)分組培養(yǎng)如下：①37℃孵箱中靜態(tài)培養(yǎng)2周；②動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)2周，比較兩組VEC分泌一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（PGI2）水平；再分別將人工機(jī)械瓣膜植入犬右心房，術(shù)后6周，取出部分材料，掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察VEC在HA材料上的附著情況，了解 HA支架材料在體內(nèi)的再細(xì)胞化能力。結(jié)果與靜態(tài)系統(tǒng)相比，人工機(jī)械瓣膜在動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)構(gòu)建膠原包埋HA涂層VEC分泌NO、PGI2水平顯著升高（P＜0．05）；在犬右心房人工機(jī)械瓣膜取出材料中，動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)構(gòu)建膠原包埋HA涂層VEC層均勻分布，并有心臟內(nèi)皮細(xì)胞附著，而靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中VEC層分布不均勻，膠原包埋HA涂層有心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞附著，而單純?nèi)斯C(jī)械瓣薄膜表面出現(xiàn)較多的血栓形成。結(jié)論動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)中構(gòu)建的組織工程化瓣膜模型中，VEC可能成為組織工程化機(jī)械瓣膜材料；膠原包埋的HA涂層人工機(jī)械瓣膜有利于VEC的黏附和生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞羥基磷灰石薄膜；犬血管內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；組織工程

2015-06-18接收

嚴(yán)中亞，男，教授，主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：yan20047 ＠163．com

目前，臨床上廣泛應(yīng)用熱解碳制成的人工心臟機(jī)械瓣膜，具有經(jīng)久耐用的優(yōu)點(diǎn)，但易出現(xiàn)表面凝血，患者往往需要終生抗凝治療［1］。脈沖激光沉積（pulsed laser deposition，PLD）技術(shù)廣泛地應(yīng)用于制備各種功能薄膜、梯度膜等，近年來(lái)，為提高人工移植物表面的生物相容性，采用各種類金剛石薄膜材料在臨床上應(yīng)用［2］。該研究采用PLD技術(shù)制備類金剛石膜，通過(guò)體外培養(yǎng)犬血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC），種植在膠原復(fù)合羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）的人工機(jī)械瓣膜上，觀察它們的生物相容性，并將此種涂有膠原復(fù)合HA薄膜的人工機(jī)械瓣膜植入犬右心房?jī)?nèi)，模擬體內(nèi)實(shí)際情況，6周后，觀察機(jī)械瓣膜上的HA涂層組織吸收代謝和再生情況。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料30只健康8月齡成年雄性 beagle犬，12～16 kg，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物處置符合安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜材料是由合肥大學(xué)和中科院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所聯(lián)合研究的新型合成的瓣膜材料，應(yīng)用PLD技術(shù)在人工心臟機(jī)械瓣膜上沉積膠原包埋HA涂層，環(huán)氧乙烷消毒，將材料制備成5 mm×5 mm×1 mm和10 mm×5 mm×1 mm大小結(jié)構(gòu)［3］。細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；Ⅱ型膠原酶、苯酚、0．25%胰蛋白酶、M199培養(yǎng)液（美國(guó)Sigma公司）；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（美國(guó)Santa Cruz公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）放射免疫試劑盒、前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用滅菌生理鹽水自制；余試劑為分析純等。

1．2試驗(yàn)主要儀器CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；BHC-1300型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；熒光倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；高速低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）。

1．3方法

1．3．1體外內(nèi)皮化進(jìn)行犬VEC的分離培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)犬編號(hào)，用3%戊巴比妥30 mg／kg緩慢血管內(nèi)麻醉后，側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，前肢懸吊，取前肢隱靜脈長(zhǎng)約10 cm，M199培養(yǎng)液沖洗血管3次，至無(wú)血液殘留；1 g／LⅡ型膠原酶注入隱靜脈使其充盈，結(jié)扎兩端，放入培養(yǎng)皿中，37℃恒溫水浴30 min，輕揉血管，收集消化液，M199培養(yǎng)液反復(fù)沖洗靜脈腔，收集灌洗液于離心管中，離心后棄上清液，加入1．5 m l M199完全培養(yǎng)液（內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)25μg／L VEGF和15%胎牛血清），重懸沉淀細(xì)胞，置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7 d后可傳代，實(shí)驗(yàn)取2～4代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1．3．2體內(nèi)內(nèi)皮化進(jìn)行細(xì)胞種植處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期2～4代的犬VEC，2．5 g／L胰酶消化后，濃度為4 ×106／L的VEC細(xì)胞懸液。將膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜在無(wú)菌條件下置入96孔板中，接種25 μl VEC細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)），37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2～3 h，吸棄未貼壁細(xì)胞。加入1 ml含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱，每天換液1次。實(shí)驗(yàn)分組如下：①膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜37℃孵箱中靜態(tài)培養(yǎng)2周；②膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置（通過(guò)微型馬達(dá)驅(qū)動(dòng)，使旋轉(zhuǎn)部件上的管形支架繞中軸作緩慢旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速60°／min）中培養(yǎng)2周。

1．3．3放射免疫法檢測(cè)兩組NO、PGI2濃度分別于培養(yǎng)3、5、7、11 d收集兩組（靜態(tài)和動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)）VEC細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，按試劑盒說(shuō)明書，采用放射免疫法檢測(cè)上清液中NO、6-酮-PGF1α（作PGI2的含量）含量。

1．3．4掃描電鏡觀察分別上述兩組培養(yǎng)有VEC細(xì)胞的人工機(jī)械瓣膜植入犬右心房，每組犬15只，術(shù)后6周，取出部分材料，磷酸鹽緩沖液清洗瓣膜表面可能的污物，2．5%戊二醛固定，梯度（50%、70%、80%、90%、100%）乙醇溶液脫水，臨界點(diǎn)干燥、噴金，Philips525M型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察 VEC在HA材料上的附著情況，了解體內(nèi)的VEC在HA材料上的附著、形態(tài)和界面情況。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17．0軟件進(jìn)行分析，其中計(jì)量資料用±s表示，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間資料分析采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1犬 VEC的觀察傳代的 VEC與鼠抗人FⅧAg多克隆抗體標(biāo)記陽(yáng)性，倒置熒光顯微鏡下，細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)狀況良好，核卵圓形，位于細(xì)胞中央，可判定細(xì)胞為VEC。倒置顯微鏡下，可見(jiàn)犬VEC在膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣材料上呈圓形，單個(gè)或成小團(tuán)存在，核圓形或卵圓形，見(jiàn)圖1。

2.2NO、PGI2測(cè)定采用放射免疫法檢測(cè)在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)中，膠原包埋HA涂層的人工機(jī)械瓣膜犬VEC分泌NO和PGI2含量。先采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)與靜態(tài)培養(yǎng)條件NO、PGI2相比，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量F值分別為6．87、7．12。與靜態(tài)培養(yǎng)條件相比，動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)NO、PGI2升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。表明動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)與體內(nèi)環(huán)境更為接近，具有與正常VEC類似的“生理功能”。見(jiàn)表1。

表1　犬VEC在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)中產(chǎn)生NO、PGI2（n＝15）

2．3形態(tài)學(xué)觀察6周后，取出犬右心房，可見(jiàn)在特制動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置下，膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜形成完整VEC層，內(nèi)皮細(xì)胞均勻分布（圖2A）；在靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，形成內(nèi)皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)不完整，HA材料上細(xì)胞分布不均勻（圖2B）；單純?nèi)斯C(jī)械瓣薄膜表面有血栓形成現(xiàn)象（圖2C）。

3　討論

由于風(fēng)濕性心臟病或感染性心內(nèi)膜炎等病變累及心臟瓣膜，常常引起患者的二尖瓣、主動(dòng)脈瓣狹窄或關(guān)閉不全，患者往往需要采用人工合成材料制成的機(jī)械瓣來(lái)替換病變心臟瓣膜即心臟瓣膜置換術(shù)。在心臟瓣膜置換術(shù)中，當(dāng)血液與機(jī)械瓣膜接觸時(shí)常激活血小板，導(dǎo)致血栓形成，患者換瓣術(shù)后往往需要終生服用抗凝藥，以防血栓形成［4］；且抗凝不當(dāng)易造成出血或栓塞，患者生活質(zhì)量嚴(yán)重受損［5］。因此，臨床上獲取理想的人工機(jī)械瓣膜，解除心臟瓣膜置換術(shù)后終生服用抗凝藥物的痛苦非常關(guān)鍵。

本研究在合肥工業(yè)大學(xué)和中科院協(xié)助下，利用PLD技術(shù)，將膠原包埋HA涂層沉積在人工心臟機(jī)械瓣膜上，通過(guò)體外內(nèi)皮化和體內(nèi)內(nèi)皮化研究膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜與VEC相容性，構(gòu)建組織工程化機(jī)械瓣膜材料，以期獲得理想的膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜，解除人工機(jī)械瓣膜置換患者術(shù)后需終生服用抗凝藥物的痛苦。膠原包埋HA涂層為一種新型的仿生復(fù)合材料，先制備納米徑粒HA，然后制備膠原，應(yīng)用PLD技術(shù)將其沉積在人工心臟機(jī)械瓣膜上，該材料主要成分是羥基磷灰石和膠原纖維，同人體骨組織結(jié)構(gòu)與成分相似［6］，其多孔隙間相通的特殊結(jié)構(gòu)為VEC生長(zhǎng)提供良好的基質(zhì)，為細(xì)胞和支架材料之間提供最大面積的貼附，有利于VEC成長(zhǎng)，且生物相容性好，無(wú)排斥反應(yīng)，為瓣膜外科手術(shù)提供了一種優(yōu)質(zhì)的全新植入材料。

本研究先進(jìn)行體外內(nèi)皮化，即通過(guò)體外培養(yǎng)VEC，種植在膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜上，觀察機(jī)械瓣膜上的HA涂層被組織吸收和瓣膜層的再生情況。研究表明，該種處理的心臟瓣膜具有無(wú)免疫原性、無(wú)需抗凝、可以生長(zhǎng)和耐久性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的較為理想的組織工程心臟瓣膜，可能為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床的組織工程心臟瓣膜奠定基礎(chǔ)［7-8］。同時(shí)，本研究又進(jìn)行了體內(nèi)內(nèi)皮化研究，將膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜植入實(shí)驗(yàn)犬的右心房中，模擬心臟內(nèi)部的微環(huán)境，6周后顯示，心臟VEC附著在HA薄膜表面，表明該項(xiàng)研究可能的光明前景。傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)VEC方法再移植入機(jī)體可能存在一定的缺陷，而動(dòng)態(tài)培養(yǎng)體系模擬微重力環(huán)境，培養(yǎng)物處于懸浮狀態(tài)［9-10］。本實(shí)驗(yàn)采用自制的動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置，VEC始終受到變動(dòng)切應(yīng)力作用，實(shí)驗(yàn)表明其促進(jìn)了VEC在膠原包埋HA人工機(jī)械瓣膜上的黏附，形成均勻的組織。VEC可分泌多種血管活性物質(zhì)，在動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)中VEC分泌NO、PGI2明顯高于靜態(tài)條件，NO、PGI2可調(diào)節(jié)血管的通透性，以及凝血-纖溶平衡系統(tǒng)，可抑制血小板聚集，拮抗血栓烷A2生成［11］，故動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)表現(xiàn)較靜態(tài)系統(tǒng)抗凝作用增強(qiáng)，抑制血栓形成。故在動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)中接種于膠原包埋HA涂層人工機(jī)械瓣膜表面VEC，不僅貼附生長(zhǎng)強(qiáng)，參與機(jī)體的代謝，形成具有“生理功能”的組織工程化瓣膜，是保持組織工程化血管流暢和防止血栓形成的重要因素。本研究將材料科學(xué)和生命科學(xué)結(jié)合起來(lái)，可能具有一定的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。

（致謝：感謝合肥工業(yè)大學(xué)理學(xué)院羅樂(lè)教授，中科院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所方曉東、陶汝華研究員在實(shí)驗(yàn)中的指導(dǎo)和材料合成）

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Experimental study of in vitro or in vivo endothelializaion in collagen
em bedding hydroxyapatite film coated artificialmechanical valve

Cheng Guangcun，Yan Zhongya，Li Chunsheng，et al
（Dept of Cardiac Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei230001）

AbstractObjectiveThrough endothelialization in vitro and in vivo，to explore the feasibility of the collagen deposit to embed hydroxyapatite（HA）coating of artificialmechanical valve and the ability of recellularization in artificialmechanical valve scaffolds．MethodsTo prepare canine vascular endothelial cells（VECs）suspension，seed in collagen embedding HA coating artificialmechanical valvematerial．The VECswere cultured in grouping as follows：①37℃ static training in the incubator②dynamic rotation cultivation device．After two weeks，to compare the secretion levels of nitric oxide（NO），prostacyclin（PGI2）in VECs of the two groups．And then，the artificial mechanical valves were implanted in right atrium of dogs respectively．After six weeks of surgery，some materials were taken out from dogs right atrium to scan by electronmicroscope and observe the adhesion situation of VECs on HA material and explore the recellularization ability of HA scaffold material in vivo．ResultsCompared with the static culture system，the secretion levels of NO and PGI2of building collagen embedding HA coating VEC ofartificialmechanical valve in dynamic rotation system were significantly elevated（P＜0．05）．In the materials taken from dog right atrialmechanical valve，collagen embedding HA coating VEC layer was distributed evenly and had cardiac endothelial cells adhesion in the dynamic rotation cuture system．The distribution of VECs layerwas uneven in static culture system．There was collagen embedding HA coatingwith heart endothelial cells adhesion too．There were some thrombosis on pure artificialmechanical valve film surface．ConclusionTo construct tissue-engineered heart valvesmodel in dynamic rotation culture system，VECsmight become a tissue-engineered mechanical valve materials．HA coating of artificial mechanical valve embeded by collagen is advantageous to the adhesion and growth of VECs．

Key wordshydroxyapatite film；vascular endothelial cells of dog；cell culture；tissue engineering

中圖分類號(hào)R 318．2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1556-04

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085MH143）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸心外科，安徽省心血管病研究所，合肥230001

作者簡(jiǎn)介：程光存，男，副主任醫(yī)師；