李新圃，李宏勝，羅金印，楊 峰，王旭榮

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州730050）

乳房炎是奶牛的常見病和多發(fā)病，由于防治難，治療花費大，給奶牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。奶牛乳房炎病因十分復(fù)雜，但主要是病原微生物通過受損乳頭和乳導(dǎo)管入侵乳腺組織引發(fā)感染。調(diào)查研究及生化鑒定試驗顯示，大約85%左右的臨床型乳房炎乳汁中能夠檢出細(xì)菌，細(xì)菌種類多達(dá)20余種，其中80%以上的病原菌為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金色葡萄球菌、大腸埃希菌和乳房鏈球菌［3-4］。目前國內(nèi)外有關(guān)奶牛乳房炎病原菌的研究多集中在上述主要致病菌［5-6］，對其他細(xì)菌的研究較少。而傳統(tǒng)的生化鑒定試驗特異性低，對大部分乳汁細(xì)菌無法確定其菌種，很難滿足當(dāng)前乳汁細(xì)菌的鑒定要求。近年來，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，細(xì)菌有了更加方便、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)鑒定方法，但由于使用成本較高、并需要一定的操作技術(shù)，尚未能在國內(nèi)普及使用［7-8］。本研究主要采用較為成熟的16SrDNA PCR鑒定技術(shù)，對采集的數(shù)百份臨床型乳房炎乳樣，進(jìn)行致病菌的分離鑒定，并對其中檢出率較高的條件性致病菌進(jìn)行毒性研究，目的是為了進(jìn)一步了解乳汁細(xì)菌的菌群分布，以及條件性致病菌的致病性和耐藥性，為奶牛乳房炎的防控提供更全面的研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備和試劑 PCR擴(kuò)增儀，凝膠成像儀，顯微鏡，電泳儀，培養(yǎng)箱，16SrDNA PCR試劑盒，細(xì)菌DNA提取試劑盒，藥敏紙片青霉素10U、氨芐西林10μg、氯霉素30μg、紅霉素15μg、卡那霉素30μg、氧氟沙星5μg、鏈霉素10μg、四環(huán)素30μg、萬古霉素30μg，質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、肺炎鏈球菌ATCC49619，MHA培養(yǎng)基，增菌肉湯，瓊脂血平面，營養(yǎng)肉湯等。

1.1.2 實驗動物 清潔級昆明小鼠，雌雄各半，6周～8周，16g～20g，由蘭州大學(xué)GLP實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集 302份奶牛臨床型乳房炎乳樣，采自甘肅、陜西、山西、寧夏等地奶牛場。用溫水清洗患病乳區(qū)，酒精棉消毒乳頭，棄去頭2把乳，擠取適量乳汁在滅菌試管中，遠(yuǎn)途乳樣擠在瓊脂斜面上。采集乳樣需冷藏保存，并盡快進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2.2 細(xì)菌分離 挑取均勻乳樣（或瓊脂斜面上的菌落）劃分在血平面上，同時接種增菌肉湯一管，37℃孵育16h～48h。從血平面上挑選單個菌落，接種到增菌肉湯中，37℃溫孵育16h～48h。進(jìn)行載玻片涂片、革蘭染色、顯微鏡觀察，已分離純化的細(xì)菌可進(jìn)入細(xì)菌鑒定程序，未分離純化的細(xì)菌需重新進(jìn)行血平面劃分，直至細(xì)菌分離純化方可進(jìn)入細(xì)菌鑒定程序。若血平面上未長菌，而相應(yīng)的增菌肉湯管長菌，則挑取肉湯管中的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行血平面劃分、純化。分離純化菌株可以加入到脫脂乳中冷凍保存。

1.2.3 細(xì)菌鑒定 使用OMEGA試劑盒提取細(xì)菌DNA，并以此作為DNA模板，使用16SrDNA PCR試劑盒進(jìn)行前500bp的DNA反應(yīng)（必要時進(jìn)行全序列DNA反應(yīng)），以及PCR擴(kuò)增、10g／L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像。對符合測序標(biāo)準(zhǔn)的目的片段，送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行基因測序。使用PubMed數(shù)據(jù)庫的在線Blast，對所得序列片段進(jìn)行搜索比對，確定細(xì)菌種屬。

1.2.4 試驗菌懸液 取試驗菌的分離純化株，接種到增菌肉湯中，在37℃溫箱中培養(yǎng)16h～48h，使細(xì)菌濃度達(dá)到5麥?zhǔn)蠞岫?，采用平板菌落計?shù)法測定試驗菌濁度，計算每毫升菌懸液中菌落形成單位（CFU／mL）。必要時用增菌肉湯稀釋細(xì)菌到試驗濁度。

1.2.5 小鼠致病性研究 選擇檢出率較高的16株糞腸球菌、18株屎腸球菌和15株化膿隱秘桿菌等條件性致病菌進(jìn)行小鼠致病性試驗。每種菌作為一個試驗組，設(shè)立對照組，每株菌使用5只小鼠，按0.5mL的注射量，小鼠腹腔注射試驗菌懸液，對照組小鼠注射增菌肉湯。連續(xù)觀察15d，每天記錄小鼠的病理變化及死亡情況，對發(fā)病死亡小鼠進(jìn)行剖解，觀察內(nèi)臟器官的病理變化，并通過培養(yǎng)肝、脾組織進(jìn)行病原重分離。挑取少許肝、脾組織劃分在血平面上，37℃孵育16h～48h，挑取單個菌落進(jìn)行涂片、染色和鏡檢，如果細(xì)菌形態(tài)特征符合試驗菌，說明試驗菌具有致病性。根據(jù)試驗組小鼠的死亡情況，在0.2mL～0.8mL之間增減試驗菌注射量，同時設(shè)立相應(yīng)的增菌肉湯對照組，測定小鼠半數(shù)致死量。

1.2.6 耐藥性研究 對以上的條件性致病菌，參照CLSL2013和衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) WS／T-125-1999，進(jìn)行耐藥性試驗。糞腸球菌和屎腸球菌使用MHA培養(yǎng)基，化膿隱秘桿菌使用含50mL／L羊血的MHA培養(yǎng)基。制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊脑囼灳鷳乙?，吸?00μL均勻點種在直徑90mm的MHA培養(yǎng)基上，涂布均勻，放置5片抗菌素藥敏紙片，倒置在培養(yǎng)箱中，37℃孵育16h～48h，測定抑菌圈直徑，判斷耐藥（R）、高敏（S）和中敏（I）。同一菌株進(jìn)行3次平行試驗，結(jié)果取其平均值，使用ATCC質(zhì)控菌株確保試驗準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 乳汁細(xì)菌的分離鑒定

共采集302份臨床型乳房炎乳樣，246份檢出細(xì)菌，其中11份同時檢出兩種細(xì)，細(xì)菌檢出率為81.5%。本次試驗共檢出257株細(xì)菌，總共包括27個種屬。常見的主要致病菌中無乳鏈球菌檢出率最高，為27.6%，其次是金色葡萄球菌檢出率7.0%，大腸埃希菌檢出率4.7%。條件性致病菌中檢出率較高的是屎腸球菌、糞腸球菌和化膿隱秘桿菌，它們的檢出率分別為7.0%、6.2%和5.8%。檢出菌中還包括益生菌乳酸乳球菌、棉籽糖乳球菌、蒙氏腸球菌和海氏腸球菌等，它們的總檢出率為10.1%。其他菌肉毒梭菌檢出率較高，為8.9%（表1）。

2.2 條件致病菌的致病性

腹腔注射7.5×108CFU～1.0×109CFU的糞腸球菌和屎腸球菌，小鼠未出現(xiàn)明顯的病理癥狀和死亡情況；腹腔注射2.4×108CFU～1.4×109CFU化膿隱秘桿菌，小鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、被毛粗亂、皮膚發(fā)暗，并在感染后1d～7d內(nèi)出現(xiàn)死亡。剖解死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟明顯腫大，發(fā)黑、質(zhì)脆，肺臟嚴(yán)重充血。接種死亡小鼠的肝、脾組織到血平面上，長出單一細(xì)菌，形態(tài)特征符合化膿隱秘桿菌?；撾[秘桿菌對小鼠的半數(shù)致死量為4.0×107CFU～2.4×108CFU。

2.3 條件致病菌的耐藥性

糞腸球菌對氨芐西林和萬古霉素高度敏感，對青霉素和鏈霉素耐藥。屎腸球菌對氨芐西林、氯霉素和萬古霉素高度敏感，對青霉素、卡那霉素和鏈霉素耐藥?；撾[秘桿菌對卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素和鏈霉素既有高敏株，也有耐藥株，對其他抗生素則呈高度敏感（表2）。

3 討論

本試驗從302份乳樣中共檢出257株細(xì)菌，主要致病菌無乳鏈球菌、金色葡萄球菌、大腸埃希菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌的總檢出率為42.4%。無乳鏈球菌的單一檢出率就是27.6%，其中90.8%的菌株來自甘肅奶牛場的乳樣。由于無乳鏈球菌屬于接觸性感染菌，主要通過擠奶員和擠奶設(shè)備傳播擴(kuò)散，因此本次試驗涉及的甘肅奶牛場，在擠奶方式和擠奶設(shè)施方面可能存在較大的衛(wèi)生隱患。山西奶牛場乳樣中的檢出菌比較特別，有肉毒梭菌、檸檬酸桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌、水拉恩菌和普羅維登斯菌等，原因尚不清楚，有待進(jìn)一步調(diào)查研究。

寧夏地區(qū)奶牛場的乳樣，檢出菌多為乳酸菌。乳酸菌是一類能發(fā)酵葡萄糖（或可利用的碳水化合物）產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，由于能夠分泌過氧化氫和細(xì)菌素，具有抑制病原菌生長的作用，常作為益生菌被研究應(yīng)用［9］，并且已被用于奶牛乳房炎的防治研究［10-12］。盡管益生菌可以抑制一些病原菌的生長，起到防病治病的目的，但是能從臨床型乳房炎乳汁中檢出，并且具有一定的檢出率，說明益生菌進(jìn)入乳腺組織，也能引發(fā)乳

房炎。因此，一般健康乳汁中能夠檢出細(xì)菌［13］，并不代表健康乳腺中原本存在細(xì)菌［14］，而是可能外界細(xì)菌入侵乳室的結(jié)果。簡單將益生菌注入乳室內(nèi)防治奶牛乳房炎的方法［15］是否可行，還需要進(jìn)一步探討。

表1 奶牛乳房炎致病菌的菌群分布Table 1 Microflora distribution for pathogenic bacteria of dairy cow mastitis

表2 條件致病菌的耐藥性Table 2 Drug resistance of opportunistic pathogens

屎腸球菌和糞腸球菌屬于乳酸菌，在2008年1126號公告中作為益生菌被規(guī)定為飼料微生物添加劑，并被研究應(yīng)用至今。但研究顯示，這兩種腸球菌均能引起人類疾病，因此也被作為條件性致病菌進(jìn)行研究報道［16］。本試驗將這兩種腸球菌作為條件性致病菌，進(jìn)行小鼠致病性研究，發(fā)現(xiàn)對小鼠沒有明顯的致病性，但對試驗抗生素表現(xiàn)出一定的耐藥性。說明奶牛乳房炎致病菌的分布具有多樣性和復(fù)雜性，可以分為主要致病菌、條件致病菌、乳酸菌和其他細(xì)菌。除主要致病菌外，條件性致病菌對小鼠也有明顯的致病性，乳酸菌一般作為益生菌使用，對小鼠沒有明顯的致病性，但是進(jìn)入到乳腺組織中，就會成為條件性致病菌引發(fā)奶牛乳房炎。

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