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銀川地區(qū)雞源沙門菌血清型鑒定及耐藥性分析

王藝暉，曹思婷，柴慧敏，李小龍，白洋，丁劍鋒，王桂琴*

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

摘要：為了解銀川地區(qū)雞源沙門菌的耐藥性及優(yōu)勢血清型，采用藥敏紙片擴(kuò)散法測定了69株雞源沙門菌對常用12種抗菌藥物的耐藥率，同時(shí)采用玻板凝集法對沙門菌進(jìn)行了血清型鑒定。結(jié)果顯示,所有菌株對12種抗菌藥物均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，其中對萘啶酸、復(fù)方新諾明、氨芐西林、頭孢唑啉的耐藥率較高；對美洛培南、環(huán)丙沙星的耐藥菌株比率較低；多重耐藥情況比較嚴(yán)重，部分菌株同時(shí)具有對12種抗菌藥物的耐藥性，具有5重耐藥能力的菌株占21.74%。分離到的菌株中主要血清型為雞白痢沙門菌(S.gallinarum)，其次為鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)和傷寒沙門菌(S.typhi)。

關(guān)鍵詞：雞;沙門菌;耐藥性;血清型

沙門菌在自然界分布廣泛，血清型眾多，目前已知的沙門菌約有2 535個(gè)血清型，46個(gè)血清組。國內(nèi)鑒定出的約有300種血清型，分屬37個(gè)血清組[1-2]。沙門菌感染是世界范圍內(nèi)重要的公共健康問題之一[3]。在我國，沙門菌導(dǎo)致的食物中毒位居食物中毒案例的首位[4]。

雞感染沙門菌可引起雞白痢、雞傷寒和副傷寒等雞沙門菌病。沙門菌可以通過水平傳播在蛋雞群中傳播，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量及蛋品質(zhì)下降；或垂直傳播(經(jīng)卵傳播)引起雛雞先天帶菌等問題。近十幾年來，雞沙門菌感染引起的蛋雞產(chǎn)蛋率下降和蛋、肉產(chǎn)品污染等問題在我國表現(xiàn)的越來越明顯，給養(yǎng)禽業(yè)帶了巨大的損失。同時(shí)，沙門菌也能感染人，引起腹瀉、嘔吐、敗血癥等，嚴(yán)重影響人的健康。本試驗(yàn)對銀川69株雞源沙門菌進(jìn)行了血清型鑒定，并對其進(jìn)行了耐藥性分析，以了解寧夏銀川地區(qū)臨床分離的雞源沙門菌流行情況及耐藥現(xiàn)狀，對于合理選擇和使用抗菌藥物，以及耐藥性監(jiān)測工作的開展具有重要的指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株沙門菌分離自銀川地區(qū)賀蘭金伯爵屠宰場、永寧三場和恒泰源雞場的健康雞的泄殖腔及盲腸；質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922購自中國藥品與生物制品檢定所。

1.1.2抗菌藥物藥敏紙片慶大霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢曲松、多西環(huán)素、阿莫西林、萘啶酸、新諾明、美洛培南、頭孢噻呋、頭孢唑啉均購自英國Oxoid Limited公司。

1.1.3主要培養(yǎng)基及試劑MH瓊脂、SC培養(yǎng)基、BHI腦心浸液培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；沙門菌CHRO Magar顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術(shù)研究所(法國科瑪嘉公司中國地區(qū)總代理)；沙門菌標(biāo)準(zhǔn)血清(60種)購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.1.4主要儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)；電熱恒溫培養(yǎng)箱；壓力蒸汽滅菌器；PCR儀；電子天平司。凝膠成像系統(tǒng)和電泳成套設(shè)備；微量可調(diào)加樣器。

1.2方法

1.2.1采樣滅菌棉簽蘸取雞泄殖腔內(nèi)容物，置滅菌肉湯中培養(yǎng)；或無菌取2日齡～3日齡雛雞盲腸一段放入增菌液中，4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2.2細(xì)菌的初步鑒定將拭子或截取的部分盲腸放入SC增菌液中，37℃培養(yǎng)16 h～24 h，取菌液劃線接種于SS瓊脂和沙門菌顯色培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h～48 h，觀察菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.2.3沙門菌PCR鑒定參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物，引物序列為16 S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16 S-R：ACGGCTACCTTGTTACGA- CTT，引物由上海英濰捷基有限公司合成。對所有初步鑒定疑似為沙門菌的菌株進(jìn)行PCR 鑒定。 PCR模板制備：水煮法提取細(xì)菌DNA。 PCR反應(yīng)體系:2×TaqPCR Master Mix 10 μL, 上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共循環(huán)30次；最后72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的片段為1 300 bp，切膠將其回收后送上海英濰捷基公司測序。

1.2.4沙門菌體外抑菌試驗(yàn)按CLSI[6]推薦的紙片法進(jìn)行，以ATCC25922作為質(zhì)控菌。試驗(yàn)結(jié)果判定按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.5沙門菌血清型鑒定沙門菌屬血清(60 種)鑒定參照沙門菌血清型鑒定方法說明書進(jìn)行。被檢菌首先用O多價(jià)及O復(fù)合和O單因子血清鑒定其O抗原，必要時(shí)以Vi血清鑒定其Vi抗原，然后以H多價(jià)及H復(fù)合和H單因子血清鑒定其H抗原， 根據(jù)Kauffmann-White抗原表檢索沙門菌的血清型[7]。 具體操作方法為用接種環(huán)于潔凈玻片上滴1滴～2滴血清，然后取少量被檢菌苔與血清混勻，輕輕搖動(dòng)玻片。同時(shí)，在玻片的另一區(qū)域取少量被檢菌苔與生理鹽水混勻作對照。1 min內(nèi)進(jìn)行觀察。呈凝集者為陽性，呈均勻渾濁者為陰性。

2結(jié)果

2.1沙門菌的鑒定結(jié)果

在沙門菌顯色培養(yǎng)基上呈圓形、微凸、邊緣整齊、紫色，直徑1 mm～2 mm的小菌落。在SS培養(yǎng)基上無色透明，有黑色中心。沙門菌鏡檢為革蘭陰性、兩端鈍圓的短桿菌，無芽胞，散在或成對。經(jīng)過PCR方法共鑒定出69株雞源沙門菌(圖1)。

2.2沙門菌的血清型鑒定結(jié)果

69株沙門菌中有63株鑒定出了血清型，6株未

能確定，優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門菌(S.gallinarum)，共27株，鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium) 14株，傷寒沙門菌(S.typhi) 9株，德比沙門菌(S.derby) 8株和塔克松尼沙門菌(S.taksony)5株。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～12.疑似沙門菌菌株

2.3沙門菌對12種抗菌藥物的敏感性

分離菌對美洛培南、和環(huán)丙沙星的敏感率最高，耐藥菌株比例最高的是萘啶酸(92.8%)，其次對復(fù)方新諾明、氨芐西林、頭孢唑啉具有耐藥性的菌株，達(dá)到50%以上，對頭孢曲松、慶大霉素等藥物的耐藥菌株比例也達(dá)到40%左右(表1)。

2.4沙門菌對12種抗菌藥物耐藥譜型分析

69株沙門菌對12種抗菌藥物的耐藥譜情況見表2，其中有5株菌株對12種抗菌藥物均敏感。

2.5沙門菌多重耐藥分析

69株分離菌株中，有5株菌對12種藥物均敏感，其余菌株有不同程度的耐藥性，其中5重藥物耐藥的菌株最多，占21.7%。其次為9重、8重和7重耐藥菌株，比例分別為12%、10%和9%。1株分離菌具有12重耐藥能力。參照多重耐藥標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)對3種藥物具備耐藥性，即可歸為多藥耐藥， 69株分離沙門菌菌株中具有多重耐藥能力的菌株占72.5%(圖2)。

表1　69株沙門菌對12種抗菌藥物的耐藥率

表2　64 株沙門菌對12種抗菌藥物的耐藥譜

注：NA為萘啶酸；CRO為頭孢曲松；CN為慶大霉素；KZ為頭孢唑林；AMP為氨芐西林；STX為復(fù)方新諾明； DO為多西環(huán)素；EFT為頭孢噻呋；AMC為阿莫西林； CIP為環(huán)丙沙星；MEM為美羅培南。

Note:NA means nalidixic acid；CRO means ceftriaxone；CN means gentamicin；KZ means cephazolin；AMP means ampicillin；STX means sulfamethoxydiazine； DO means doxycycline；EFT means ceftiofur；AMC means amoxicillin； CIP means ciprofloxacin；MEM means meropenem.

3討論

3.1沙門菌的耐藥率情況

根據(jù)對寧夏銀川地區(qū)雞場分離出的沙門菌進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)分析可知，該地區(qū)沙門菌耐藥現(xiàn)象普遍比較嚴(yán)重。在本次分離出的沙門菌對萘啶酸、氨芐西林的耐藥性最為嚴(yán)重，對比諸葛石養(yǎng)等[8]對廣西分離到的158株雞源沙門菌的研究結(jié)果，其分離株對萘啶酸、氨芐西林均嚴(yán)重耐藥，耐藥率均達(dá)到80%以上，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，說明不同地區(qū)使用抗菌藥物種類、方式、數(shù)量相似，其耐藥性的發(fā)生率也會(huì)比較接近。本試驗(yàn)中，沙門菌對氨芐西林的耐藥率為63.8%，比郭琍等[9]報(bào)道的100%要低，這可

圖2　沙門菌對12種抗菌藥物多重耐藥情況

能是由于菌種來源的不同以及人與動(dòng)物使用青霉素類藥物的種類和頻率不同造成。通常細(xì)菌的耐藥性可以過食物鏈傳播給人類[10-11]，動(dòng)物源沙門菌新的耐藥機(jī)制的出現(xiàn)，將對人源沙門菌耐藥性產(chǎn)生一定的影響。所以在食用動(dòng)物上正確的選擇用藥，對控制耐藥菌株的傳播有非常重要的意義。

3.2多重耐藥情況分析

研究發(fā)現(xiàn)，從禽養(yǎng)殖場分離的沙門菌對大多數(shù)臨床使用的抗菌藥物已普遍產(chǎn)生耐藥性，而且細(xì)菌的耐藥率越來越高，對抗菌藥物的交叉耐藥現(xiàn)象越發(fā)嚴(yán)重，多重耐藥感染日益增加，并且這樣的情況在國內(nèi)養(yǎng)殖場中非常普遍[12]。本次耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌同時(shí)對喹諾酮類、青霉素類、頭孢菌素類抗菌藥物耐藥的菌株達(dá)到72.5%，這與陳希文等[13]報(bào)道的研究結(jié)果一致。對5種抗菌藥物耐藥的菌株所占比例最大，占到21.7%,對10種以上抗菌藥物耐藥的菌株所占比例為7.3%，同時(shí)，有1株菌對12種藥物全部耐藥。通過本次研究驗(yàn)證了沙門菌對抗菌藥物已產(chǎn)生了嚴(yán)重的多藥耐藥，合理使用抗菌藥物是控制該菌耐藥的關(guān)鍵。如對3種及3種以上藥物同時(shí)耐藥即可歸為多重耐藥，那么本次試驗(yàn)菌株的多重耐藥率為72.5%。由此推斷，細(xì)菌在藥物的使用壓力下能很快產(chǎn)生耐藥性，使用抗菌藥種類越多，產(chǎn)生的耐藥譜就會(huì)越廣,形成多重耐藥,這與潘志明等[14]的研究結(jié)果相符。部分資料的研究結(jié)果顯示[15-16]，耐藥性不僅僅是反復(fù)用藥的結(jié)果，也是沙門菌在不利環(huán)境中增強(qiáng)生存能力的自身防衛(wèi)的結(jié)果，這也是沙門菌容易產(chǎn)生耐藥性的原因。

3.3血清型鑒定分析

63株分離菌株中雞沙門菌優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門菌(S.gallinarum)，共27株，14株為鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)，9株為傷寒沙門菌(S.typhi)。這與劉翔等[17]的研究結(jié)果有所差異。其中鼠傷寒沙門菌同為優(yōu)勢血清型，但其檢出腸炎沙門菌的比例較多，說明不同地區(qū)來源的沙門菌血清型分布有較大差異。從病禽中分離到的沙門菌具有廣泛的感染對象，但根據(jù)沙門菌生長環(huán)境和宿主的不同，其血清型差異較大[18-19]，如2006年食品檢出沙門菌優(yōu)勢血清型在泰國為斯坦利沙門菌(S.stanley)，在日本為嬰兒沙門菌(S.infantis)，在亞洲各國主要為鼠傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、德比沙門菌、腸炎沙門菌等[20]。通過對銀川地區(qū)沙門菌血清型的鑒定，為有效防治沙門菌病以及抗菌藥物的選用具有重要的指導(dǎo)意義，也是調(diào)查銀川地區(qū)沙門菌血清型分布的參考依據(jù)之一。

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Serotype Identification and Drug Resistance Analysis ofSalmonellaIsolated

from Chicken in Yinchuan

WANG Yi-hui, CAO Si-ting, CHAI Hui-min, LI Xiao-long, BAI Yang, DING Jian-feng, WANG Gui-qin

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia, 750021,China)

Abstract:In order to know the serotype and antimicrobial resistance of Salmonella isolated from chicken in Yinchuan，the antimicrobial resistance of 69 Salmonella strains to 12 drugs were determined by the methods of disk diffusion and serotypes were tested using glass plate agglutination. The results showed that all 12 antibacterial agents had different degrees of resistances, which had a high resistance to nalidixic, sulfamethoxazole, ampicillin and cefazolin. The resistant rates were lower to meropenem, chloramphenicol and ciprofloxacin. The resistance was serious and all isolates tolerated up to 12 kinds of drugs. The main resistance spectrum was 5 kinds of drugs and accounted for 21.74%. The main serotypes were S. gallinarum, S. typhimurium and S.typhi.

Key words:chicken;Salmonella;antimicrobial resistance;serotype

文章編號(hào):1007-5038(2015)11-0121-04

中圖分類號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

作者簡介：王藝暉(1991-)，女，寧夏銀川人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。 *

通訊作者

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 31160519)

收稿日期：2015-04-10