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牛支原體蛋白-蛋白相互作用網絡的構建

劉威1，袁芳艷1，周丹娜1，劉澤文1，楊克禮1，段正贏1，郭銳1，肖少波2，田永祥1*

(1. 湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎與分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；2. 華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430064)

摘要：病原菌的相互作用組學研究是揭示潛在信號轉導通路和新型藥物靶標的有力工具。通過同源蛋白映射的方法構建了牛支原體的蛋白-蛋白相互作用網絡，所構建的互作網絡包含138個蛋白和693個相互作用關系。通過蛋白的互作頻率分析，確定了在牛支原體中互作頻率最高的20個蛋白，這些蛋白主要與轉錄、翻譯、分子伴侶等功能相關。進一步分析發(fā)現(xiàn)，伴侶蛋白DnaK和ClpB發(fā)生互作的頻率較高，能與核糖體蛋白、代謝相關蛋白等多種功能蛋白發(fā)生相互作用。結果提示，若DnaK和ClpB的功能受到抑制，將會對牛支原體的正常生命活動造成較大的影響。

關鍵詞：牛支原體；蛋白相互作用；互作網絡

牛支原體(Mycoplasmabovis)是感染牛的一種重要的致病性病原體，可導致牛肺炎、耳炎、乳腺炎、關節(jié)炎、角膜炎、流產或不孕等多種疾病[1-2]。該病在世界范圍內廣泛存在，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經濟損失[3]。據初步統(tǒng)計，歐洲每年約25%～33%的犢牛肺炎是由牛支原體引起，造成的直接經濟損失高達1.44億～1.92億歐元，其中英國每年約190萬頭?；贾гw肺炎；美國每年因牛支原體感染造成的經濟損失約1.40億美元[4]。2008年，在中國湖北省首次發(fā)現(xiàn)了疑似牛肺疫的呼吸道疾病，發(fā)病2 476頭(發(fā)病率高達50%～100%)，死亡610頭，隨后貴州省和寧夏回族自治區(qū)也報道了類似病例[5]。通過檢測核酸，發(fā)現(xiàn)此呼吸道疾病并非牛肺疫復發(fā)，而是一種我國從未出現(xiàn)過的新發(fā)支原體傳染病[6]。目前，已有內蒙古、廣西、天津、重慶、四川、河南等10多個省市自治區(qū)報道了類似疫情，牛支原體已經成為威脅我國養(yǎng)牛業(yè)的重要病原[7]。

牛支原體感染后的臨床癥狀與牛肺疫類似，感染初期癥狀不明顯，待出現(xiàn)明顯癥狀時，病情已十分嚴重。感染初期，病牛體溫升高至39℃～40℃，食欲不振，精神沉郁，呼吸急促，干咳，有黏液性或化膿性鼻分泌物[8]。隨著病情加劇，體溫繼續(xù)升高至40℃～41℃，采食量急劇下降，清晨和采食后咳嗽明顯，使用抗生素治療后病情略有好轉，但病情反復，隨后病畜開始死亡，大部分病牛剖檢后肺部可觀察到明顯的粘連[9]。目前世界上僅有兩家美國公司的牛支原體疫苗獲得美國農業(yè)部授權，但是并沒有充足的數(shù)據證實疫苗保護的有效性[10]。一方面，牛支原體的抗體水平與保護率并不一致，即使抗體在機體中處于較高水平，但是長途運輸和飼養(yǎng)環(huán)境變化，依然可以誘發(fā)牛支原體肺炎的暴發(fā)。另一方面，牛支原體菌株表面存在一個由13個基因組成的Vsp家族，Vsp蛋白容易發(fā)生漂移，繼而引起抗原表位的變化，這也是疫苗保護效果并不理想的又一個重要原因[11]。在藥物治療方面，支原體由于缺乏細胞壁，對常用的作用于細胞壁的抗生素不敏感。一些牛支原體敏感的藥物，如四環(huán)素類、喹諾酮類藥物，因為在養(yǎng)殖生產中的大量使用甚至濫用，催生出了許多耐藥菌株，顯著降低了抗生素的治療效果[12]。利用現(xiàn)代生物信息學和分子生物學技術尋找牛支原體新的藥物靶標，將為牛支原體病的防控奠定堅實的基礎，為新型藥物的研發(fā)提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1基因組序列與數(shù)據庫牛支原體Hubei-1的全基因組序列來源于NCBI數(shù)據庫，氨基酸序列通過Artemis導出。直系同源分析時涉及到的數(shù)據來源于Database of Interaction Protein(DIP)數(shù)據庫(數(shù)據更新至20150101)。

1.2方法

1.2.1同源蛋白映射DIP數(shù)據庫中蛋白與蛋白間的互作關系已經通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等試驗驗證確定。同源蛋白映射(HPM)是通過整合試驗中已確定的蛋白-蛋白相互作用信息，來預測未知蛋白間的互作網絡[13]。圖1展示了同源蛋白映射的原理。如DIP數(shù)據庫中C與D能發(fā)生互作，而蛋白A與C同源，B與D同源，那么A和B極可能發(fā)生相互作用?；诖送ㄟ^HPM構筑蛋白-蛋白相互作用網絡。

1.2.2相互作用網絡的構建DIP數(shù)據庫中的氨基酸序列從DIP網站上下載獲得(20150101)。Blast軟件包和牛支原體的基因組序列從NCBI FTP服務器下載。利用Formatdb將牛支原體的氨基酸序列建庫，DIP數(shù)據庫中的氨基酸序列與牛支原體氨基酸序列的同源性通過Blastp確定(E-value 1e-30)(表1)。Blastp得到的初步比對結果通過本實驗室設計的script程序映射成互作網絡，以獲得最終的牛支原體蛋白-蛋白相互作用網絡。蛋白-蛋白相互作用網絡通過可視化軟件Cytoscape[14]展示。

2結果

2.1牛支原體蛋白-蛋白相互作用網絡

牛支原體蛋白-蛋白相互作用網絡通過同源蛋白映射的方法構建完成(圖1)。預測的蛋白互作網絡中包含138個蛋白和693個相互作用關系，蛋白用圓形的節(jié)點表示，相互作用關系用直線表示。

圖1　同源蛋白映射方法的原理

程序/數(shù)據庫名稱Software/database主要用途Mainuses網絡資源NetworkresourceArtemis基因組可視化Visualizationofgenomehttp://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/Blastp同源比對Sequencehomologyanalysishttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Cytoscape可視化分析Visualizationanalysiswww.cytoscape.org/COG蛋白質功能分類Classificationofproteinfunctionhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/COGDIP蛋白相互作用數(shù)據庫DatabaseofInteractingProteinhttp://dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgiPerlPerl語言Perllanguagehttp://www.perl.org/

2.2蛋白相互作用發(fā)生頻率的分析

在蛋白-蛋白相互作用網絡中，互作頻率表示某單一蛋白與其他蛋白發(fā)生相互作用的數(shù)量?；プ黝l率較高的蛋白往往參與細胞的多種生命活動，在細胞的生存中起著十分關鍵的作用。表2列出了互作頻率最高的20個蛋白，在這20個蛋白中，大多數(shù)蛋白與轉錄、翻譯、分子伴侶等功能相關。MMB0149和 MMB0664分別編碼伴侶蛋白DnaK和ClpB，這兩個蛋白的互作頻率較高，且都能與核酸代謝蛋白(如MMB0047等)、運輸相關蛋白(如SecA等)、DNA復制與修復相關蛋白(如MMB0242，MMB0606等)、氨基酸合成相關蛋白(如MMB0192等)發(fā)生相互作用。若DnaK和ClpB的功能受到抑制，將嚴重影響牛支原體的生存和繁殖，結果提示DnaK和ClpB可以作為新型藥物的潛在靶標。

2.3蛋白相互作用網絡中不同功能蛋白的分布

蛋白質直系同源簇(COGs)數(shù)據庫是對細菌、藻類和真核生物的21個完整基因組的編碼蛋白，根據系統(tǒng)進化關系分類構建而成。COGs庫常用于未知蛋白的功能預測和蛋白功能的分類研究中。我們對牛支原體蛋白相互作用網絡中互作頻率高于10次的蛋白進行了功能分布分析，首先將互作頻率高于10次的蛋白根據蛋白質直系同源簇(COGs)數(shù)據庫進行功能分類，隨后對不同COGs功能類別的蛋白個數(shù)進行統(tǒng)計分析。結果如圖3所示：互作頻率較高的功能蛋白主要與核糖體結構、復制、翻譯、分子伴侶和防御等功能相關。核糖體是細胞內一種核糖核蛋白顆粒，由RNA和蛋白質構成，其唯一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質多肽鏈，是細胞內蛋白質合成的分子機器。MMB0182編碼DNA拓撲異構酶，拓撲異構酶是生物體內的基礎酶類，參與到所有涉及DNA拓撲結構變化的生命活動中，如DNA的復制，轉錄和重組。細菌細胞中，三分之一的蛋白質是在合成后被轉運到細胞質外才發(fā)揮功能的。其中大多數(shù)蛋白是通過Sec途徑(即分泌途徑secretion pathway)進行跨膜運動的。MMB0288編碼水解ATP的動力蛋白SecA，SecA和膜蛋白三聚體SecYEG共同構成了Sec轉運酶的核心。MMB0192編碼磷酸核糖焦磷酸，是一種重要的代謝中間物，參與嘌呤核苷酸與嘧啶核苷酸的從頭合成和補救合成、某些核苷酸類輔酶如輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ、以及某些氨基酸如組氨酸和色氨酸的合成。上述蛋白在維持細胞正常的生命活動中都起著十分關鍵的作用，若這些蛋白的功能受到抑制將嚴重影響牛支原體的生存與繁殖。

圖2　 牛支原體蛋白-蛋白相互作用網絡

3討論

病原菌互作蛋白組學分析是解析毒力相關信號通路和挖掘潛在藥物靶標的重要工具[13]。本研究通過HPM的方法構建了牛支原體的蛋白-蛋白相互作用網絡，所構建的互作網絡包括138個蛋白和693個相互作用關系。HPM的方法主要通過計算蛋白序列的同源性，因此會造成少數(shù)假陽性的結果。為了減少假陽性的發(fā)生，我們在構建互作網絡時，通過結合序列覆蓋率和E-value[15]值綜合評價單一蛋白和互作關系的準確性，以確定最終的蛋白互作網絡。

在蛋白-蛋白相互作用網絡中，蛋白發(fā)生互作的頻率越高，提示這一蛋白在病原菌的生命活動中越重要。在完成了牛支原體蛋白互作網絡的構建后，通過COGs對互作頻率最高的20個蛋白進行了功能分類。在這20個蛋白中，大多數(shù)蛋白與轉錄、翻譯、分子伴侶等功能相關。分子伴侶和核糖體蛋白往往在細胞的生命活動中起著關鍵的作用，如伴侶蛋白能幫助蛋白正確折疊和降解，這對細胞內病原菌抵抗宿主細胞的環(huán)境壓力十分重要。在牛支原體蛋白互作網絡中，DnaK和ClpB發(fā)生互作的頻率較高，能與核糖體蛋白、代謝相關蛋白等多種蛋白發(fā)生相互作用。一旦DnaK和ClpB的功能受到抑制，將會對牛支原體的正常生命活動造成不小的影響。綜上所述，通過HPM的方法構建了牛支原體蛋白-蛋白相互作用網絡，蛋白互作網絡的構建將為新型藥物靶標的尋找、新的信號分子的篩選提供依據。

表2　相互作用網絡中互作頻率較高的20個蛋白

C.能量產生和轉換；E.氨基酸運輸和代謝；F.核酸運輸和代謝；G.碳水化合物運輸和代謝；H.輔酶代謝；J.翻譯，核糖體結構和產生；K. 轉錄；L. DNA復制，重組和修復；O.轉譯后的修飾，伴侶蛋白；R.常規(guī)功能；U.細胞內運輸，分泌和囊膜運輸；V.防衛(wèi)機制

C.Energy production and conversion；E.Amino acid transport and metabolism；F.Nucleotide transport and metabolism；G. Carbohydrate transport and metabolism；H.Coenzyme metabolism；J.Translation, ribosomal structure and biogenesis；K.Transcription；L.DNA replication, recombination and repair；O.Posttranslational modification, protein turnover, chaperones；R.General function prediction only；U.Intracellular trafficking, secretion and vesicular transport；V.Defense mechanisms

圖3 牛支原體蛋白相互作用網絡中不同功能蛋白的分布

Fig.3The COGs distribution in the protein-protein interaction network ofMycoplasmabovis

參考文獻:

[1]Morton J,Malmo J,House J,et al.Mycoplasmabovisin Australian dairy herds[J]. Aust Vet J,2014, 92(9)：322-323.

[2]張瑞，崔朋，巴曉亮，等．牛支原體臨床分離株牛體毒力和免疫原性比較[J]．動物醫(yī)學進展，2013，34(6)：126-132．

[3]Aebi M,van den Borne BH,Raemy A,et al.Mycoplasmabovisinfections in Swiss dairy cattle: a clinical investigation[J]. Acta Vet Scand，2015，57:10. doi: 10.1186/s13028-015-0099-x.

[4]胡長敏，石磊，龔瑞，等. 牛支原體病研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展，2009，30(8)：73-77.

[5]石磊，龔瑞，尹爭艷，等. 肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的初步診斷[J]. 華中農業(yè)大學學報，2008，27(4)：572-572.

[6]辛九慶，李媛，郭丹，等. 國內首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2008，30(9)：661-664.

[7]伍曉紅，儲岳峰，張軒，等．牛支原體的分離鑒定及16S rRNA基因序列分析[J]．動物醫(yī)學進展，2012，33(12)：35-37．

[8]冉智光，謝建華，駱璐，等. 我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關節(jié)炎的病原體診斷[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(1)：40-43.

[9]Radaelli E,Luini M,Loria G R,et al. Bacteriological, serological, pathological and immunohistochemical studies ofMycoplasmabovisrespiratory infection in veal calves and adult cattle at slaughter[J]. Res Vet Sci,2008,85(2): 282-290.

[10]Mulongo M,Prysliak T,Perez C J,et al. Vaccination of feedlot cattle with extracts and membrane fractions from twoMycoplasmabovisisolates results in strong humoral immune responses but does not protect against an experimental challenge[J]. Vaccine,2013,31: 1406-1412.

[11]Li Y,Zheng H,Liu Y,et al. The complete genome sequence ofMycoplasmabovisstrain Hubei-1[J]. PLoS One,2011,6(6): e20999.doi: 10.1371/Journal.pone.0020999.

[12]Bürki S,Frey J,Pilo P,et al. Virulence, persistence and dissemination ofMycoplasmabovis[J]. Vet Microbiol,2015,pii: S0378-1135(15)00079-6. doi: 10.1016/j.vetmic.

[13]Cui T,Zhang L,Wang X,et al.Uncovering new signaling proteins and potential drug targets through the interactome analysis of Mycobacterium tuberculosis[J]. BMC Genomics,2009,10:118.doi:10.1186/1471-2164-10-118.

[14]Shannon P,Markiel A,Ozier O,et al.Cytoscape:a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J]. Genome Res,2003,13:2498-2504.

[15]Zhaxybayeva O,Gogarten J P.Bootstrap, Bayesian probability and maximum likelihood mapping: exploring new tools for comparative genome analyses[J]. BMC Genomics，2002，3:4.

動物醫(yī)學進展,2015,36(11):20-24ProgressinVeterinaryMedicine

Construction of the Protein-protein Interaction Network ofMycoplasmabovis

LIU Wei1, YUAN Fang-yan1, ZHOU Dan-na1, LIU Ze-wen1, YANG Ke-li1,

DUAN Zheng-ying1,GUO Rui1, XIAO Shao-bo2, TIAN Yong-xiang1

(1.HubeiProvincialKeyLaboratoryofAnimalEmbryoandMolecularBreedingofAnimalHusbandry

andVeterinaryResearchInstituteofHubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan,Hubei,430064,China;

2.StateKeyLaboratoryofagriculturalmicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430064,China)

Abstract:Analysis of the pathogen interactome is a powerfull approach for dissecting potential signal trasducion and new drug targets. We constructed a comprehensive protein-protein interaction network for Mycoplasma bovis consisting of 138 proteins and 693 interaction pairs. Our analysis unraveled 20 proteins with highest interactions in the network, most of them are related to the function of transcription, translation and molecular chaperone. The MMB0149/ MMB0664 gene and its gene product DnaK/ClpB were analyzed in detail because they showed high interactions with ribosomal and metabolism related proteins. Our analyses indicated that the chaperone DnaK and ClpB may be critical for the survival of Mycoplasma bovis. Collectively, this study therefore provides valuable clues in exploring new signaling protein and new drug targets.

Key words:Mycoplasma bovis; protein interaction; interaction network

文章編號:1007-5038(2014)11-0020-05

中圖分類號:S852.62;S852.653

文獻標識碼:A

作者簡介：劉威(1985-)，男，湖北武漢人，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病研究。 *

通訊作者

基金項目：湖北省農業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項目(2015-620-004-001)

收稿日期：2015-05-12