張 倩，齊曉楠，楊文浩，叢 霞，李華濤，曹榮峰，田文儒

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島266109）

牛雄性生殖干細胞（male germ stem cell，mGSC）是位于睪丸曲細精管基膜上，具有增殖和分化潛能的干細胞，能夠產(chǎn)生精子，將遺傳信息傳給后代［1］。Brinster R L等［2］將可育小鼠的雄性生殖干細胞移植到不育小鼠的睪丸中建立了精子發(fā)生。生殖干細胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為克隆動物［3］、治療雄性不育以及一些人類遺傳疾病的細胞治療［4］提供了新的機遇與途徑。

目前mGSC的研究主要包括其分離純化與鑒定，構(gòu)建穩(wěn)定增殖的mGSC體外培養(yǎng)體系［5］。Kanatsu-Shinohara M 等［6］首次建立了小鼠生殖干細胞體外長期培養(yǎng)體系，并成功獲得了多能性生殖干細胞。然而，睪丸生殖細胞的研究多集中在鼠等小動物上，大動物生殖干細胞的體外研究比較困難，其分離和培養(yǎng)條件扔處于摸索階段［7］?？偨Y(jié)近年來的研究發(fā)現(xiàn)，牛睪丸生殖干細胞所采用的培養(yǎng)條件相差各異，且一直未建立穩(wěn)定的體外長期培養(yǎng)體系。睪丸生殖干細胞的分離和培養(yǎng)是進行生殖干細胞功能活性鑒定和精子發(fā)生機理等研究的基礎(chǔ)。因此，建立牛睪丸生殖干細胞體外培養(yǎng)體系具有重要科研意義。

目前體外培養(yǎng)睪丸生殖干細胞多采用將分離純化到的生殖干細胞接種于支持細胞或成纖維細胞飼養(yǎng)層上的方法，同時培養(yǎng)基中成分復雜，多添加多種營養(yǎng)因子如干細胞生長因子（stem cell factor，SCF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子（glialcellline derived neurotrophic factor，GDNF）、分化誘導因子（differentiation inducing factor，DIF）和谷氨酰胺等［8］，然而，生精干細胞的分離純化不僅工作繁瑣而且細胞密度選擇仍需摸索，同時所添加的營養(yǎng)因子價格昂貴。為此，本試驗探索了在培養(yǎng)基不添加營養(yǎng)因子的情況下，通過優(yōu)化睪丸支持細胞密度的方法共培養(yǎng)睪丸生殖干細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 取初生犢牛睪丸，酒精消毒后用PBS或生理鹽水沖洗，浸泡于含100mL／L雙抗的PBS緩沖液中，于冰上2h內(nèi)帶回實驗室。

1.1.2 主要試劑 膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM F-12、新生牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；AKP試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品；100×青鏈霉素混合液為索萊寶公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為原平皓公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；LightCycler?480SYBR GreenⅠ Master為Roche公司產(chǎn)品；試驗用水均為超純水，本試驗中所用試劑除特別說明的以外，其余均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 睪丸支持細胞和生殖干細胞混合細胞懸液的制備和培養(yǎng) 犢牛睪丸曲細精管上皮只有2種細胞，即睪丸支持細胞和睪丸生殖干細胞。獲取犢牛睪丸曲細精管上皮細胞懸液采用兩步酶消化法。除去附睪、脂肪墊、微血管及睪丸白膜，撥散睪丸組織小塊后吸管吹打、靜置離心獲取曲細精管小段。1.5g／L膠原酶溶液室溫振蕩消化10min后1 000 r／min離心5min，然后2.5g／L胰酶溶液37℃消化5min，終止消化后400目篩網(wǎng)過濾，1 000r／min離心5min，棄上清后用含100mL／L胎牛血清的DMEM-F12重懸細胞，得到支持細胞和生殖干細胞的混合細胞懸液。

1.2.2 HE染色 待混合培養(yǎng)的犢牛睪丸曲細精管上皮細胞鋪滿培養(yǎng)皿時進行HE染色：用PBS清洗細胞后加入950mL／L乙醇室溫固定15min；洗滌后加入蘇木精室染8min，自來水藍化10min后加入10mL／L伊紅水溶液染色15s，水洗拍照。

1.2.3 AKP（堿性磷酸酶）染色鑒定 待混合培養(yǎng)的兩種細胞出現(xiàn)細胞集落時進行AKP鑒定：洗滌細胞后用40mL／L多聚甲醛室溫固定2min，洗棄固定液后加入2mL BCIP／NBT工作液（用2mL堿性磷酸酶顯色緩沖液、6.67μL BCIP（300×）和13.3μL NBT（150×）配制 BCIP／NBT 染色工作液）充分覆蓋樣品，然后室溫避光孵育1h，去除工作液后蒸餾水洗滌終止顯色反應(yīng)并拍照。

1.2.4 睪丸生殖干細胞的純化及試驗分組 為獲取純度較高的生殖干細胞懸液，對于原代培養(yǎng)的牛睪丸細胞在接種培養(yǎng)12h后吸取上清。此時支持細胞已貼壁完全，干細胞部分貼壁，因此獲取的上清細胞懸液為睪丸生殖干細胞。以1 000r／min離心5min，調(diào)整細胞密度為1×104個／mL，準備接種與支持細胞上。選擇不同生長密度的支持細胞共培養(yǎng)睪丸生殖干細胞。待純化培養(yǎng)的第3代支持細胞分別長到約225、1 300、5 600個／cm2時接種密度為1×104個／mL的生殖干細胞細胞懸液1mL，用25 mL／L血清濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)6d時，任選5個視野，記錄集落數(shù)并計算集落與支持細胞的比例。

1.2.5 RT-PCR方法檢測特異性基因SCF、OCT-4的表達 提取不同密度支持細胞共培養(yǎng)體系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測支持細胞的標志基因SCF和生殖干細胞OCT-4的表達（表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，40個循環(huán)；72℃7min。

表1 引物列表Table 1 Primer information of RT-PCR

1.2.6 熒光定量PCR方法檢測SCF、OCT-4mRNA表達 提取不同密度支持細胞共培養(yǎng)體系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后將合成的cDNA產(chǎn)物做一系列濃度梯度稀釋，用 Roche Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀進行定量反應(yīng)，反應(yīng)體系（10μL）：ddH2O 3.6μL；SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5μL；上、下游引物（20pmoL／μL ）各0.2μL（表1）；cDNA 1μL。反應(yīng)條件：95℃ 10min；95℃10s，60℃20s，72℃30s，45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，各組細胞以GAPDH做為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法進行相對定量分析，其中ΔCT＝目的基因CT-內(nèi)參基因 CT；ΔΔCT＝ 試驗組 ΔCT-對照組ΔCT［1］。

2 結(jié)果

2.1 犢牛睪丸支持細胞和生殖干細胞的形態(tài)特點

睪丸支持細胞貼壁后呈長條形，貼壁生長性強，在培養(yǎng)皿底壁逐漸生長成樹枝狀；支持細胞的細胞核多位于細胞基部，呈橢圓形，核仁明顯，常有多個（圖1和圖2）；HE染色后，支持細胞胞核嗜堿性弱，染色較淺（圖2）。

睪丸生殖干細胞較支持細胞貼壁晚，常貼于支持細胞上或其附近，細胞貼壁后呈圓形或橢圓形；細胞核呈圓形或卵圓形，核質(zhì)比較大；生精細胞常聚集生長，形成細胞團，隨培養(yǎng)時間延長增殖能力強的生殖干細胞逐漸形成細胞集落；細胞集落亮度大，多呈圓形，突出生長（圖1和圖2）；HE染色后，睪丸生殖干細胞細胞膜多數(shù)完整光滑，細胞核嗜堿性較強染色較深（圖2）。

圖1 犢牛睪丸支持細胞和生殖干細胞混合培養(yǎng)（A～B.Bar＝100μm，C～D.Bar＝30μm）Fig.1 The mixed culture of calf testis SCs and GSCs（A-B.Bar＝100μm；C-D.Bar＝30μm）

圖2 犢牛睪丸支持細胞和生殖干細胞混合培養(yǎng)（HE，Bar＝100μm）Fig.2 The mixed culture of calf testis SCs and GSCs（HE，Bar＝100μm）

2.2 共培養(yǎng)體系中牛睪丸生殖干細胞的生長特征

培養(yǎng)睪丸曲細精管上皮細胞懸液12h后棄上清并將血清濃度換成25mL／L繼續(xù)混合培養(yǎng)兩種細胞，3d后生殖干細胞增殖較快，多集中生長并漸漸出現(xiàn)發(fā)亮的集落（圖3a），4d后生殖干細胞生長進入指數(shù)階段，于支持細胞上層生長旺盛（圖3b），6d時集落數(shù)進一步增加（圖3c），然而培養(yǎng)皿中細胞總量已很大，繼續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)接觸抑制。原代培養(yǎng)的混合細胞，當干細胞基本鋪滿上層時進行AKP染色，原代干細胞集落染色多呈輻射狀（圖4）。

2.3 不同密度的第3代支持細胞培養(yǎng)生殖干細胞

用低接種密度（225個／cm2）支持細胞共培養(yǎng)生殖干細胞時，長出的生殖干細胞集落比例最大，且干細胞集落純度較大、集落體積也較大（圖5a）。用中接種密度（1 300個／cm2）和高接種密度（5 600個／cm2）支持細胞共培養(yǎng)生殖干細胞時，支持細胞增長速度快于生精細胞，干細胞集落比例較低，體積較小，由于支持細胞細胞速度生長較快，鋪滿平皿后出現(xiàn)接觸抑制（圖5b和圖5c）。

圖3 犢牛睪丸曲細精管上皮細胞培養(yǎng)（Bar＝100μm）Fig.3 The cultute of calf testis seminiferous tuble epithelial cells（Bar＝100μm）

圖4 犢牛睪丸生殖干細胞的AKP染色（Bar＝60μm）Fig.4 The calf testis GSCs with AKP-staining（Bar＝60μm）

表2 各組共培養(yǎng)體系中生殖干細胞集落比例數(shù)Table 2 The clones′proportion in different co-culrute system

圖5 4d時不同密度支持細胞共培養(yǎng)體系細胞圖（a.Bar＝50μm；b～c.Bar＝100μm）Fig.5 The co-culture system with different density of SCs on the fourth day（a.Bar＝50μm，b-c.Bar＝100μm ）

2.4 牛睪丸支持細胞和生殖干細胞特異性基因的鑒定

RT-PCR結(jié)果顯示分析不同密度SC培養(yǎng)GSC時，各密度培養(yǎng)體系均表達干細胞特異基因OCT-4和支持細胞特異基因SCF（圖6）。

圖6 不同密度共培養(yǎng)體系中牛睪丸生殖干細胞和支持細胞標志基因RT-PCR鑒定Fig.6 Identification of calf mGSC and SC markers by RT-PCR in different density co-culture systems

2.5 不同密度支持細胞共培養(yǎng)體系中SCF、OCT-4的相對表達量

熒光定量PCR結(jié)果顯示，采用低密度SC培養(yǎng)干細胞特異性基因OCT-4的相對表達量極顯著高于中密度SC培養(yǎng)和高密度SC培養(yǎng)（P＜0.01）；中密度和高密度間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖7 OCT-4和SCF灰度比值Fig.7 The gray value of OCT-4／SCF

3 討論

構(gòu)成曲細精管的上皮是一種特殊的復層上皮，管壁上皮細胞分支持細胞和生精細胞兩類，支持細胞分布在各級生精細胞之間［9］，對生精細胞具有營養(yǎng)、支撐、保護等多種作用［10］。以支持細胞為飼養(yǎng)層體外共培養(yǎng)時，支持細胞貼壁較早，能夠產(chǎn)生較大的伸展面積，有利于生殖干細胞貼壁［11］；同時支持細胞會分泌多種生物活性因子，如神經(jīng)膠質(zhì)細胞源營養(yǎng)因子（GDNF1）［12］、干細胞因子（SCF）［13］等以促進干細胞的增殖；此外，支持細胞之間以及支持細胞和干細胞之間形成的特殊連結(jié)構(gòu)成了生精細胞生長的微環(huán)境，同時有利于某些調(diào)節(jié)因子的信號傳導［14］。

因此，目前培養(yǎng)睪丸生殖干細胞多采用以支持細胞或者成纖維細胞做飼養(yǎng)層［15］，同時為促進生殖干細胞增殖，選用的培養(yǎng)基條件嚴格，通常加入多種昂貴的營養(yǎng)因子［8］。其目的是更好的促進干細胞生長，以期進一步純化干細胞，提高干細胞在共培養(yǎng)體系中的比例。鑒于此，本試驗對接種睪丸干細胞前的支持細胞飼養(yǎng)層密度進行了選擇，在不添加SCF、GDNF等昂貴營養(yǎng)因子的條件下，簡便、經(jīng)濟、有效地培養(yǎng)睪丸生殖干細胞。

3.1 共培養(yǎng)體系中睪丸支持細胞和生殖干細胞的鑒定

根據(jù)李德雪等的研究方法［16-19］，本試驗HE染色結(jié)果、光學顯微鏡觀察結(jié)果以及AKP染色結(jié)果顯示，體外混合培養(yǎng)的犢牛睪丸曲細精管上皮細胞呈現(xiàn)睪丸支持細胞和生精細胞的兩種形態(tài)特征。根據(jù)于磊等［20］對睪丸支持細胞及張仕強等［21］對睪丸生殖干細胞特異性標志物的鑒定，本試驗經(jīng)RTPCR發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的細胞均能夠表達睪丸支持細胞特異基因SCF和干細胞特異基因OCT-4；同時熒光定量PCR結(jié)果說明，隨著支持細胞密度的不同，SCF和OCT-4的相對表達量發(fā)生變化，即生殖干細胞和支持細胞數(shù)量比發(fā)生變化，OCT-4／SCF比值越高則干細胞比例越大。

3.2 共培養(yǎng)時睪丸支持細胞密度的選擇

曲細精管上皮內(nèi)的支持細胞和生精細胞須要保持一定的比例，有利于生精細胞的發(fā)育及精子的產(chǎn)生［22］。本試驗發(fā)現(xiàn)，低密度的支持細胞培養(yǎng)生殖干細胞能夠顯著增加干細胞集落比例數(shù)及集落體積；同時顯著升高干細胞特異性基因OCT-4／支持細胞特異性基因SCF。說明雖然支持細胞是體外培養(yǎng)生殖干細胞的不可或缺因素，但是，支持細胞跟生精細胞的比例卻不是越大越好。高密度的支持細胞并不利于生殖干細胞集落的生成，即高密度支持細胞不利于生殖干細胞的增殖。其原因可能是：支持細胞密度高，其吸收營養(yǎng)過多、產(chǎn)生的細胞代謝產(chǎn)物也較多，同時支持細胞增殖速度較快不能給生殖干細胞足夠的生長空間，從而抑制生殖干細胞的增殖；而較低密度的支持細胞共培養(yǎng)既能滿足生殖干細胞的生長要求，又不至于吸收過多的營養(yǎng)、產(chǎn)生過多代謝產(chǎn)物以及搶占生存空間，因此干細胞集落純度較大。

體外培養(yǎng)睪丸生殖干細胞時，采用較低密度的支持細胞共培養(yǎng)可獲得理想的睪丸生殖干細胞。這種方法既節(jié)省了昂貴的外加營養(yǎng)因子，同時操作簡便、效果理想。然而，根據(jù)理論猜測，密度并非越低越好，因此還需進一步試驗，以篩取更佳的支持細胞共培養(yǎng)密度。

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