朱芳萍 呂偉旗 張青蓮 吳春美

藏紅花有效成分含量比較與相關(guān)性研究

朱芳萍 呂偉旗 張青蓮 吳春美

目的 比較藏紅花有效成分含量及影響因素，為藏紅花高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培與優(yōu)良種質(zhì)選育提供依據(jù)。方法 在2010年版藥典與現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，優(yōu)化藏紅花有效成分含量HPLC測(cè)定方法，并測(cè)量比較11個(gè)產(chǎn)地藏紅花中有效成分含量，用DPS軟件分析經(jīng)緯度、海拔與有效成分含量間的相關(guān)性。結(jié)果 西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ分別在6.236～62.356μg/mL以及3.158～31.584μg/mL范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2分別為0.9997與0.9996，兩者平均回收率分別為99.9%（RSD=1.69%，n=9）與99.4%（RSD=0.86%，n=9）；11個(gè)產(chǎn)地藏紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花總苷含量存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）；經(jīng)度與西紅花有效成分含量呈正相關(guān)關(guān)系，海拔、緯度與西紅花有效成分含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)論 本方法測(cè)定藏紅花有效成分含量簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，我國(guó)引種的藏紅花有效成分含量高，質(zhì)量好，低緯度、高經(jīng)度地區(qū)并視種質(zhì)選擇海拔高度區(qū)別種植藏紅花有利于有效成分積累。

藏紅花；有效成分；含量；相關(guān)性

藏紅花crocus sativus L.學(xué)名西紅花、番紅花，系鳶尾科番紅花屬植物，原產(chǎn)西班牙、伊朗等地，因其經(jīng)印度轉(zhuǎn)入西藏再銷(xiāo)往國(guó)內(nèi)各地而得名[1]?；ㄖ喜考爸^入藥，具有強(qiáng)烈的活血化瘀和散郁開(kāi)結(jié)之功效，是有效的婦科良藥，治療婦女閉經(jīng)、產(chǎn)后瘀血腹痛有獨(dú)特療效[2-4]。西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ是2010年版《藥典》規(guī)定的藏紅花主要有效成分，藥理學(xué)研究表明，藏紅花具有改善微循環(huán)，提高免疫力，抗動(dòng)脈硬化，抗氧化，降血脂，利膽保肝，防治骨質(zhì)疏松，保護(hù)腎臟等功效[5-10]。藏紅花在我國(guó)浙江、河南、上海、江蘇、新疆、西藏等地均有栽培，因栽培地南北跨度大，不同產(chǎn)地栽培的藏紅花在物候期、農(nóng)藝性狀、有效成分含量等方面存在差異。筆者收集了全國(guó)主要產(chǎn)區(qū)11批樣品，采用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地藏紅花進(jìn)行西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量測(cè)定，并分析了經(jīng)緯度、海拔與有效成分含量間的相關(guān)性，以期為藏紅花高產(chǎn)栽培與質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Waters1525高效液相色譜儀：1525μ泵、2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、7725Ⅰ型手動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze3.0版的色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司，機(jī)型：Milli-Q Academic）；DGG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品（Crocin-Ⅰ，純度＞97%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-11071108）；西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌罚–rocin-Ⅱ，純度＞98%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-11091002）；甲醇（色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司）；乙醇（分析級(jí)，安特公司）；水為去離子水，其它試劑均為分析純。供試藥材2012年10月—2012年11月采自浙江、江蘇、河南、上海等不同產(chǎn)地，經(jīng)麗水市人民醫(yī)院副主任藥師吳春美鑒定為鳶尾科番紅花屬植物番紅花crocus sativus L.的柱頭，詳見(jiàn)表1。

表1 供試不同產(chǎn)地藏紅花藥材統(tǒng)計(jì)

1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱Agligent eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，4.6μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水（48∶52，V/V），采用等度洗脫條件，時(shí)間為45min；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：440nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL。按上述色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀。

1.3 溶液制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌愤m量，置25mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。得濃度為0.624mg/mL的西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品溶液和0.316mg/ mL的西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌啡芤海糜?℃冰箱避光保存，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末10mg，置25mL容量瓶中，加適量50%乙醇溶解，40℃超聲處理30min，放至室溫，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔膜濾過(guò)即得。

1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品西紅花苷-Ⅰ（0.624mg/mL）與西紅花苷-Ⅱ（0.316mg/mL），移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL容量瓶中，加50%乙醇稀釋定容，在“1.2.1”色譜條件下測(cè)定。以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌啡芤旱馁|(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)x，峰面積為橫坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。計(jì)算得西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ線(xiàn)性范圍分別為6.236～62.356μg/mL以及3.158～31.584μg/mL，回歸方程以及相關(guān)系數(shù)分別為：y=388.87x-33.547，R2=0.9997；y=392.94x-144.5，R2=0.9996，見(jiàn)表2。

1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取8號(hào)樣品，按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液，放入適宜的開(kāi)口容器中，置于以下條件保存：①高溫度試驗(yàn)：40℃，避光；②高濕度試驗(yàn)：室溫，相對(duì)濕度（90±5）%，避光；③強(qiáng)光照射試驗(yàn)：室溫，（4500±500）Lux光照強(qiáng)度下照射。分別于0、2、4、6、8、10、12、24進(jìn)樣，在“1.2.1”色譜條件下測(cè)定峰面積，計(jì)算得各條件下西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD（n=8）值，結(jié)果表明供試品溶液在強(qiáng)光照射條件下不穩(wěn)定，在高溫度、高濕度避光保存條件下24h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表3。

1.6 精密度試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“1.2.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得西紅花苷-Ⅰ的色譜峰面積RSD=0.88%，西紅花苷-Ⅱ的色譜峰面積RSD= 1.67%，表明儀器精密度良好，見(jiàn)表4。

表2 西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ線(xiàn)性關(guān)系考察

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取8號(hào)樣品5份，按“1.2.2.2”供試品溶液的制備操作，在“1.2.1”的色譜條件下測(cè)定含量，得西紅花苷-Ⅰ的平均含量為10.88%，RSD為1.28%，西紅花苷-Ⅱ的平均含量為3.53%，RSD為1.24%，見(jiàn)表5。

1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量的西紅花樣品10mg，9份，分低、中、高三組，每組3份，分別加入西紅花苷-Ⅰ（0.624mg/ mL）對(duì)照品溶液各0.90，0.75和0.50mL；西紅花苷-Ⅱ（0.316mg/mL）對(duì)照品溶液分別加入0.49、0.41和 0.33mL，按照“1.2.2.2”供試品溶液的制備操作，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率（%）=（C-A）/ B×100%，A為樣品中被測(cè)成分的含量，B為加入對(duì)照品的量，C為實(shí)際測(cè)得含量。結(jié)果見(jiàn)表6，西紅花苷-Ⅰ的平均回收率為99.9%，RSD為1.69%；西紅花苷-Ⅱ的平均回收率為99.4%，RSD為0.86%。

1.9 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取樣品適量，按“1.2.2.2”供試品溶液的制備操作，在“1.2.1”的色譜條件下對(duì)不同產(chǎn)地11個(gè)藏紅花樣品進(jìn)行西紅花苷含量測(cè)定，重復(fù)3次，計(jì)算總苷含量=西紅花苷-Ⅰ含量+西紅花苷-Ⅱ含量。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

表4 精密度試驗(yàn)

表5 重復(fù)性試驗(yàn)（%）

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 藏紅花有效成分含量HPLC法優(yōu)化 分別對(duì)西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ色譜峰進(jìn)行吸收光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ色譜峰在440nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與2010年版《藥典》中西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ的測(cè)定波長(zhǎng)一致。因此，選擇440nm作為西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ的檢測(cè)波長(zhǎng)。在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上[8，11-13]，對(duì)西紅花苷提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了乙醇濃度為40%、50%、60%，提取時(shí)間為20、30、40min，提取溫度為30、40、50、60℃對(duì)西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ提取含量的影響，結(jié)果表明，用50%乙醇，40℃條件下超聲30min即可提取完全，且操作簡(jiǎn)便、快捷，供試品溶液中雜質(zhì)成分含量低，不干擾待測(cè)成分的檢驗(yàn)。同時(shí)比較了幾種不同流動(dòng)相比例，發(fā)現(xiàn)以甲醇：水=48：52（V：V）為流動(dòng)相較好，選用的流動(dòng)相條件使得西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ兩個(gè)化合物的峰行好，出峰時(shí)間早，分離度好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 11個(gè)產(chǎn)地藏紅花有效成分含量比較 不同產(chǎn)地藏紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ與總苷含量存在差異（P＜0.05，P＜0.01），浙江產(chǎn)藏紅花中西紅花總苷含量較高，其中最高為浙江建德1樣品，總苷含量達(dá)到18.48%，江蘇與河南產(chǎn)藏紅花中西紅花總苷含量相對(duì)較低，江蘇太倉(cāng)與河南三門(mén)峽樣品含量最低，總苷含量?jī)H為12.35%，詳見(jiàn)表7。我國(guó)藏紅花主產(chǎn)地浙江、江蘇、河南、上海所產(chǎn)藏紅花中西紅花總苷含量均達(dá)到2010年版藥典要求（總苷含量不低于10.0%），總苷平均含量達(dá)14.92%。從有效成分含量看，我國(guó)引種藏紅花較為成功，所產(chǎn)藏紅花品質(zhì)好，長(zhǎng)江三角洲地區(qū)較適合藏紅花選育栽培，為藏紅花良種選育奠定了基礎(chǔ)。

2.3 海拔、經(jīng)緯度與有效成分相關(guān)性分析 產(chǎn)地的立地條件對(duì)中藥材藥效成分的積累具有一定影響，包括海拔、年平均氣溫、經(jīng)緯度、光照等。本試驗(yàn)分析顯示，藏紅花產(chǎn)地海拔、經(jīng)緯度與有效成分含量存在相關(guān)性，其中經(jīng)度與西紅花有效成分含量呈正相關(guān)關(guān)系，海拔、緯度與西紅花有效成分含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；緯度與有效成分含量間相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到西紅花苷-Ⅰ含量（0.61712）、西紅花苷-Ⅱ含量（0.67684）、西紅花總苷含量（0.67503），見(jiàn)表8。從各指標(biāo)相關(guān)性看，低海拔、低緯度、高經(jīng)度地區(qū)種植藏紅花有利于有效成分含量積累。

表7 不同產(chǎn)地藏紅花中西紅花苷含量比較（%）

3 討論

藏紅花性平，味甘，歸心、肝經(jīng)，主要功效為活血化瘀，涼血解毒，解郁安神，用于經(jīng)閉癓瘕，產(chǎn)后瘀阻，溫毒發(fā)斑，憂(yōu)郁痞悶，驚悸發(fā)狂。同時(shí)，藏紅花又可用于開(kāi)發(fā)功能性食品、天然色素、保健化妝品等，再次成為人們研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，但是藏紅花資源極其有限，致使價(jià)格昂貴，一直被譽(yù)為“植物黃金”。我國(guó)醫(yī)藥所需的藏紅花主要依靠進(jìn)口，雖然進(jìn)行引種栽培，提供少量商品，但因種源少，適宜栽培的地區(qū)有限，栽培技術(shù)要求較高等綜合因素，滿(mǎn)足不了市場(chǎng)的需求，出現(xiàn)了供不應(yīng)求的局面。收集我國(guó)藏紅花主產(chǎn)區(qū)藏紅花栽培資源，進(jìn)行有效成分含量比較、經(jīng)緯度等相關(guān)性分析，對(duì)篩選藏紅花優(yōu)良種質(zhì)，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培等研究均有重要意義。

圖1 高效液相色譜圖A.西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品；B.西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?；C.供試樣品；1.西紅花苷-Ⅰ；2.西紅花苷-Ⅱ

表8 海拔、經(jīng)緯度與有效成分含量相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我國(guó)藏紅花主產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)藏紅花中主要有效成分均符合2010年版《藥典》中西紅花總苷含量不得少于10%的要求；11個(gè)產(chǎn)地藏紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ與總苷含量均存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），浙江產(chǎn)藏紅花中西紅花總苷含量較高，江蘇與河南產(chǎn)藏紅花中西紅花總苷含量相對(duì)較低；經(jīng)度與西紅花有效成分含量呈正相關(guān)關(guān)系，海拔、緯度與西紅花有效成分含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果顯示低海拔、低緯度、高經(jīng)度地區(qū)種植藏紅花有利于西紅花總苷含量積累，但是低海拔地區(qū)藏紅花進(jìn)入盛花期時(shí)間往往比高海拔地區(qū)推遲半個(gè)月，這樣反倒不利于產(chǎn)量的提高，也延遲了大田移栽期，減少了大田生長(zhǎng)時(shí)間，不利于來(lái)年種球生長(zhǎng)。因此，藏紅花高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培需綜合考慮干花成品、種球的質(zhì)量與產(chǎn)量，同時(shí)結(jié)合栽培地不同立地條件與不同藏紅花種質(zhì)的特性多方面考慮。據(jù)筆者多年調(diào)查研究藏紅花大田生長(zhǎng)習(xí)性與室內(nèi)開(kāi)花習(xí)性，并結(jié)合本試驗(yàn)可知，我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)所產(chǎn)藏紅花種質(zhì)，種球生長(zhǎng)所需大田應(yīng)位于低緯度地區(qū)，室內(nèi)培育開(kāi)花場(chǎng)地應(yīng)視具體種質(zhì)而定，長(zhǎng)江中下游種質(zhì)室內(nèi)培育開(kāi)花位于中高海拔地區(qū)，而河南等北方種質(zhì)應(yīng)位于低海拔地區(qū)，這樣可提高藏紅花有效成分積累，增加種球質(zhì)量與產(chǎn)量。

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（收稿：2014-08-06 修回：2014-11-18）

Com parison of the Active Com ponent Contents in Crocus Sativus and Their Correlation w ith Site Condi-tion

ZHU Fangping,LV Weiqi,ZHANG Qinglian,WU Chunmei.Department of Pharmacy,the Six Hospital affiliated to Wenzhou Medical University,Lishui(323000),China

Objective To detect the active component contents in Crocus sativus and investigate the influence factor on them,in order to provide scientific basis for high yield and quality cultivation of Crocus sativus and selection of good germ plasm.M ethods Based on China Pharmacopeia published in 2010 and the existing evidence, the HPLC method for determination of active component contents in Crocus sativus was optimized.The active component contents in Crocus sativus planted in 11 different producing area were determined and compared.DPS software was used to find the relationship between latitude,longitude,height,and the active components.Results The linear ranges of crorin-I and crorin-II were 6.236-62.356μg/mL and 3.158-31.584μg/mL,the R2 were 0.9997 and 0.9996,and the average recovery rates were 99.9%（RSD=1.69%,n=9）and 99.4%（RSD=0.86%,n=9）,respectively.Significant difference in crorin-I,crorin-II,and total contents was found between Crocus sativus produced in different areas（P＜0.05 or P＜0.01）.A positive correlation was seen between active component contents and the longitude of producing area;a negative correlation was seen between active component contents and the latitude and height of producing area.Conclusion The optimized HPLC method for determining the active component contents in Crocus sativus is convenient,accurate,and repeatable.The quality of Crocus sativus cultivated in China is high. Cultivation of Crocus sativus in areas with low latitude,high longitude and varied heights according to different germplasm will be benefit.

Crocus sativus;Active components;Content;Correlation

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院藥劑科（麗水市人民醫(yī)院）（麗水 323000）

吳春美，Tel：0578-2292513