官清華，丁啟龍(中國藥科大學藥學醫(yī)學基礎實驗教學中心，江蘇南京211198)

細胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位對NAFLD肝細胞線粒體功能的影響

官清華，丁啟龍△
(中國藥科大學藥學醫(yī)學基礎實驗教學中心，江蘇南京211198)

［摘要］目的:研究細胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位( EhCys/CySS)對非酒精性脂肪肝( NAFLD)肝細胞線粒體功能的影響。方法:用EhCys/CySS分別為0 mV(氧化)、－80 mV(正常)和－150 mV(還原)的氧化還原培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細胞株LO2并采用油酸誘導細胞建立NAFLD模型。熒光探針DCFH-DA和MitoSOX分別檢測細胞整體水平和線粒體活性氧簇( ROS)生成，使用apocynin( NADPH氧化酶抑制劑)和MitoQ(10)(靶向線粒體抗氧化劑)、rotenone(線粒體呼吸鏈復合體I抑制劑)和antimycin A(線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ抑制劑)作用細胞檢測線粒體復合體活性從而探究ROS的來源，JC-1檢測細胞線粒體膜電位。結果:油酸誘導的NAFLD細胞模型使肝細胞內ROS增多，線粒體膜電位下降;氧化的EhCys/CySS加劇了NAFLD肝細胞ROS的生成以及線粒體膜電位的下降，而還原的EhCys/CySS能清除ROS并逆轉線粒體膜電位的下降。線粒體ROS清除劑MitoQ(10)能顯著地減少氧化的EhCys/CySS所增加的ROS，而apocynin效果不明顯。Rotenone作用于細胞后，ROS的增長率與細胞外EhCys/CySS有關，氧化狀態(tài)下ROS增長率最小且復合體I活性減弱，即氧化的EhCys/CySS能通過抑制線粒體復合體I增加ROS的生成。結論:氧化的EhCys/CySS能通過抑制線粒體復合體I，從而加劇NAFLD肝細胞ROS的生成，并使線粒體膜電位進一步下降，而還原的EhCys/CySS能減少高脂所致ROS生成并減輕線粒體損傷。

［關鍵詞］半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位;活性氧;非酒精性脂肪肝;線粒體

如今，越來越多的研究者關注細胞外氧化還原狀態(tài)對細胞內過程及細胞功能的調控作用。Jones等［1-2］研究發(fā)現半胱氨酸( cysteine，Cys) /胱氨酸( cystine，CySS)電對是人體血漿中最主要的小分子量硫醇/二硫化物物質對，Cys/CySS電對的電位( Eh)能用來評價及量化細胞外的氧化還原狀態(tài)，且人正常血漿EhCys/CySS為－80 mV，氧化的血漿電位( EhCys/CySS＞－62 mV)往往伴隨著疾病?；谶@一理論，大量研究證明EhCys/CySS能調節(jié)許多重要的細胞內過程，包括增殖、黏附、分化及凋亡［3-6］，涉及多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，包括動脈粥樣硬化、肥胖和糖尿?。?-5，7］。此外，繼Jones等［2］發(fā)現2型糖尿病、化療及心血管疾病的早期癥狀伴隨血漿EhCys/CySS氧化，Imhoff等［5］研究表明高脂飲食會導致C57B16小鼠血漿EhCys/CySS氧化，氧化的EhCys/CySS能加劇脂肪細胞脂質生成，而還原的EhCys/CySS能減少脂肪細胞中脂質的含量。由此可見，血漿中EhCys/CySS在高脂致脂質代謝性疾病的形成過程中可能起著重要的調控作用。高脂飲食所致的非酒精性脂肪肝( nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)作為常見的脂質代謝性疾病，常常是肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化的并發(fā)癥。既往研究表明在高脂所致的NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應激起著關鍵作用［8］。因此，本實驗主要觀察細胞外EhCys/CySS對高脂培養(yǎng)的LO2肝細胞ROS生成、來源及線粒體功能的研究，以進一步了解高脂致NAFLD的病理生理機制。

材料和方法

1實驗材料

1.1實驗細胞LO2人正常肝細胞株由中國藥科大學藥學醫(yī)學基礎實驗教學中心提供。

1.2主要實驗儀器及試劑Olympus BX51型熒光顯微鏡; Thermo Scientific Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀; DMEM、Cys-free DMEM培養(yǎng)基( Gibco) ; Cys、CySS( AMRESCO) ;熒光探針MitoSOX ( Invitrogen) ;油酸、熒光探針DCFH-DA、antimycin A ( Sigma) ; apocynin( TCI) ; Rotenone(阿拉丁公司)。Cys、CySS儲備液:取適量Cys和CySS溶于Cys-free DMEM，分別配成10 mmol/L的Cys和10 mmol/L的CySS儲備液。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)及分組將LO2細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清及青霉素-鏈霉素)中，置于37℃、5% CO2、具有一定濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育，2 d換1次液。傳代分瓶設對照( control，C)組和油酸( oil acid，OA)組，每組又設有0 mV(氧化)、－80 mV(正常)和－150 mV(還原)電位梯度，每3 h換新鮮電位培養(yǎng)基至細胞達到80%，OA組加油酸再孵育6 h且油酸終濃度為0. 3 mmol/L，模擬高脂飲食造肝細胞NAFLD模型［9］。

2.2Cys/CySS電位液的配置根據人血漿中Cys 和CySS濃度［10］，調節(jié)Cys-free DMEM培養(yǎng)基中Cys 和CySS濃度，配制成相應的電位液。即將10 mmol/ L的Cys和CySS儲備液添加到Cys-free DMEM中得到不同的EhCys/CySS電位液［11］，電位的計算符合能斯特方程: Eh=－250 +30 log(［CySS］/［Cys］2) (電位單位: mV;濃度單位: mol/L)。配置1 mL EhCys/ CySS電位液所需的CySS和Cys儲備液量見表1［3］。

表1　Cys/CySS電位液中Cys和CySS的濃度Table 1.Redox media formulations with Cys and CySS

2.3熒光顯微鏡及全波長掃描式多功能讀數儀檢測ROS［5］細胞用電位液和油酸處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，用檢測活性氧的熒光探針DCFH-DA ( 10 μmol/L，檢測細胞內的ROS，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)或者MitoSOX( 5 μmol/L，檢測線粒體內的ROS，激發(fā)波長510 nm，發(fā)射波長580 nm) 于37℃分別繼續(xù)孵育細胞30 min和10 min。然后用PBS洗3次，除去未進入細胞的熒光探針。加入2 mL PBS，熒光顯微鏡檢測拍照并傳代法收集細胞，全波長掃描式多功能讀數儀檢測各組熒光強度，實驗重復3次。

2.4熒光顯微鏡檢測線粒體膜電位細胞用電位液和油酸處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入JC-1染液，使終濃度為1. 5 mg/L，37℃孵育30 min，PBS 洗3遍后用熒光顯微鏡檢測。當JC-1濃度低或膜電位水平低時，主要以單體形式存在，激發(fā)波長為527 nm，呈綠色熒光;當JC-1濃度升高或線粒體膜電位水平較高時，形成聚合物，發(fā)出紅色的熒光，激發(fā)波長為590 nm［12］。線粒體對JC-1的攝取依賴于跨膜電位，正常的肝細胞線粒體膜電位高，呈現紅色熒光;細胞損傷后，線粒體膜電位下降呈現由紅色到綠色的熒光轉變［13］。應用Image-Pro Plus 6. 0專業(yè)圖像分析軟件對熒光圖片進行統計分析。

3統計學處理

采用SPSS 10. 0統計軟件分析，數據以均數±標準差( mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1細胞外EhCys/CySS對高脂培養(yǎng)LO2細胞ROS生成的影響

以0. 3 mmol/L油酸處理LO2細胞造肝細胞NAFLD模型。用活性氧熒光探針DCFH-DA和MitoSOX分別標記細胞內和線粒體內ROS，熒光顯微鏡下拍照，熒光酶標儀檢測ROS強度。與C組相比，相同EhCys/CySS下，油酸使OA組細胞內綠色熒光和線粒體內紅色熒光增強，即ROS增多;各組中氧化的細胞外狀態(tài)( 0 mV)下細胞內和線粒體內熒光明顯增強，表明ROS增多，而還原的細胞外狀態(tài)(－150 mV)下的細胞相應指標均減弱，見圖1。

Figure 1.The effects of EhCys/CySS on ROS generation in the OA treated LO2 cells (×400).Mean±SD.n =6.##P＜0. 01 vs C(－150 mV) group;*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs C (－80 mV) group;△△P＜0. 01 vs C( 0 mV) group;+ +P＜0. 01 vs OA(－80 mV) group.圖1　EhCys/CySS對NAFLD肝細胞ROS生成的影響

2氧化的細胞外狀態(tài)下LO2細胞ROS的來源

既往研究發(fā)現，細胞內ROS來源主要是線粒體和NADPH氧化酶。為了了解氧化的細胞外狀態(tài)( 0 mV)作用下LO2細胞ROS的來源，實驗中使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin［14］和線粒體內ROS清除劑MitoQ10［15］處理氧化狀態(tài)下培育的細胞。結果顯示，由氧化的EhCys/CySS增加的細胞內ROS，在apocynin的作用下輕微地減少了，而MitoQ10使增加的ROS顯著地減少了( P＜0. 01)，見圖2。

Figure 2.The source of ROS in the LO2 cells treated with the oxidized EhCys/CySS.Mean±SD.n =6.△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs C( 0 mV) ;##P＜0. 01 vs C(－150 mV) ;＊＊P＜0. 01 vs C(－80 mV) ;+ +P＜0. 01 vs rotenone(－80 mV).圖2　氧化的EhCys/CySS作用下LO2細胞ROS的來源

3氧化的EhCys/CySS抑制線粒體復合體I活性

由上面的實驗可知，氧化的細胞外狀態(tài)下LO2細胞ROS主要來源于線粒體。為了進一步探究線粒體內ROS產生機制，實驗針對線粒體呼吸鏈產生ROS的環(huán)節(jié)，選擇線粒體復合體I和III的抑制劑，rotenone( 2 μmol/L)和antimycin A( 5 μmol/L)［16］。實驗結果顯示，2種抑制劑作用后都使細胞ROS生成增加;但是antimycin A孵育細胞后，各組細胞ROS的增加率與細胞外EhCys/CySS無關，而復合體I抑制劑rotenone作用后ROS的增加率與細胞外EhCys/ CySS呈相關趨勢，即0 mV時增加了23. 5%，－150 mV時增加了151. 6%。實驗說明氧化的EhCys/ CySS可能通過抑制線粒體復合體I活性來增加ROS的生成。

使用線粒體呼吸鏈復合體I活性檢測試劑盒進一步驗證實驗假設。結果顯示0 mV時線粒體復合體I的活性只有正常狀態(tài)下細胞的42%，而－150 mV時細胞復合體I活性輕微增強，實驗結果進一步證明了氧化的EhCys/CySS通過抑制線粒體復合體I活性來增加ROS的生成，見圖2。

4細胞外EhCys/CySS對LO2細胞線粒體膜電位的影響

如圖3所示，與C組相比，油酸使OA組細胞線粒體膜電位下降，JC-1染色由紅色向橙色轉變，綠色熒光與紅色熒光的比值由65%增長到82% ( P＜0. 01) ;與正常生理狀態(tài)(－80 mV)相比，氧化狀態(tài)( 0 mV)使NAFLD肝細胞線粒體膜電位進一步下降，JC-1染色由橙色向綠色轉變，綠色/紅色熒光比值由82%增長到110%( P＜0. 01) ;還原狀態(tài)(－150 mV)逆轉了NAFLD肝細胞線粒體膜電位的下降，JC-1染色呈紅色，綠色/紅色熒光比值由82%降低到71%( P＜0. 05)，見圖3。

討論

與正常肝臟相比，脂肪肝肝細胞脂質沉積增加了線粒體β-氧化，ROS增多造成氧化應激，ATP生成減少，線粒體功能紊亂。能量代謝障礙越嚴重，肝細胞對脂肪的處理轉運能力越低，肝細胞中脂質沉積也越多，形成惡性循環(huán)，這在NAFLD發(fā)病機制中起重要作用［8］。Cys/CySS組成了人血漿中最主要的低分子量硫醇/二硫化物物質對［1］，肥胖、糖尿病、化療、酗酒、抽煙等往往伴隨著血漿中EhCys/CySS的氧化［2］，越來越多研究表明氧化的EhCys/CySS與脂質代謝性疾病的危險因素有關。Imhoff等［5］研究表明高脂飲食會導致小鼠血漿EhCys/CySS氧化，細胞實驗進一步說明細胞外液氧化的EhCys/CySS能加劇脂肪細胞脂質生成，而還原的EhCys/CySS能改善脂質沉積。Thong等［17］研究發(fā)現N-乙酰半胱氨酸能改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠氧化應激和肝脂質沉積及炎癥癥狀。而且，N-乙酰半胱氨酸作為L-cysteine的前體，能使血漿中EhCys/CySS還原［18］。因此，血漿中氧化的EhCys/CySS可能對NAFLD發(fā)生發(fā)展起重要作用。

Figure 3.The effects of EhCys/CySS on the mitochondrial membrane potential of OA treated LO2 cells.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs OA(－80mV).圖3　EhCys/CySS對LO2細胞線粒體膜電位的影響

本研究通過細胞實驗，以Cys、CySS和Cys-free DMEM培養(yǎng)基模擬人體氧化、正常和還原的細胞外環(huán)境培育LO2細胞并以油酸建立NAFLD模型。研究中發(fā)現油酸NAFLD模型能使細胞ROS增加線粒體膜電位降低，而氧化的EhCys/CySS( 0 mV)加劇了ROS的生成并使線粒體膜電位進一步下降，還原的EhCys/CySS(－150 mV)能清除ROS并糾正降低的膜電位。線粒體ROS清除劑MitoQ10顯著減少了由氧化EhCys/CySS所增加的ROS。線粒體復合體I抑制劑rotenone作用于細胞后，ROS的增長率與細胞外EhCys/CySS有關，0 mV時ROS的增長率很小并且線粒體復合體I活性減弱。實驗說明，對于高脂培養(yǎng)的LO2肝細胞，細胞外液氧化的EhCys/CySS能通過抑制線粒體復合體I加劇肝細胞ROS的生成，并使線粒體膜電位降低，而還原的EhCys/CySS能減少高脂所致ROS生成并改善線粒體損傷。線粒體膜電位下降表明線粒體功能障礙，即可引起線粒體能量儲備減少及氧化應激增強，導致脂質變性的肝細胞對二次打擊的抵抗能力降低。

綜上，高脂飲食能使動物血漿EhCys/CySS氧化，高脂培養(yǎng)能導致LO2肝細胞內ROS增多，氧化的細胞外EhCys/CySS能通過抑制線粒體復合體I加劇NAFLD肝細胞ROS的生成，并使線粒體膜電位進一步下降，而還原的EhCys/CySS能清除ROS并改善線粒體損傷。實驗根據細胞外EhCys/CySS對肝細胞線粒體功能的影響，進一步認識高脂通過細胞外氧化還原狀態(tài)來影響細胞內的功能，這有助于深入探究NAFLD的病理機制。關于高脂是如何氧化血漿EhCys/CySS及由此引發(fā)的氧化的EhCys/CySS對NAFLD進程的影響，如肝脂質沉積、炎性反應、纖維化等機制有待進一步研究。

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Extracellular cysteine/cystine redox potential affects mitochondrial function in NAFLD LO2 cells

GUAN Qing-hua，DING Qi-long
( Experimental and Teaching Center of Medical Basis for Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China.E-mail: g637cpu@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of extracellular cysteine/cystine redox potential ( EhCys/CySS) on the mitochondrial function of nonalcoholic fatty liver disease ( NAFLD) hepatocytes.METHODS: LO2 cells were incubated with EhCys/CySS of the oxidized ( 0 mV)，the normal (－80 mV)，or the reduced (－150 mV) status medium，then treated with oleic acid to establish NAFLD model in vitro.DCFH-DA and MitoSOX were used as the fluorescent probes for determining reactive oxygen species ( ROS).Apocynin ( NADPH oxidase inhibitor)，MitoQ(10)( mitochondria-targeted antioxidant)，rotenone ( mitochondrial respiratory chain complex I inhibitor) and antimycin A ( mitochondrial respiratory chain complex III inhibitor) were used to investigate the sources of ROS.RESULTS: An increase in ROS in LO2 cells by oleic acid was aggravated by the oxidized extracellular EhCys/CySS ( 0 mV)，which was removed by the reduced EhCys/ CySS (－150 mV).ROS generation by 0 mV was significantly eliminated by MitoQ(10).ROS levels were dependent on extracellular EhCys/CySS in rotenone treated LO2 cells.A decline of mitochondrial membrane potential in the cells with NAFLD was aggravated by 0 mV and reversed by－150 mV.CONCLUSION: The oxidized extracellular EhCys/CySS via inhibitiing of complex I intensifies ROS generation and reducing the mitochondrial membrane potential in the NAFLD hepatocytes，which were reversed by reduced EhCys/CySS.

［KEY WORDS］Cysteine / cystine redox potential; Reactive oxygen species; Nonalcoholic fatty liver disease; Mitochondria

通訊作者△Tel: 025-86185359; E-mail: g637cpu@163.com

［收稿日期］2015-01-06［修回日期］2015-03-26

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1266-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.020