鄭國沛，賈小婷，彭　聰，賀智敏(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，廣東廣州510095)

miR-205通過靶向調(diào)控TBX18抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力*

鄭國沛，賈小婷，彭聰，賀智敏△
(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，廣東廣州510095)

［摘要］目的:探討微小RNA-205 ( miR-205)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達模式及其在膠質(zhì)瘤細胞侵襲中的作用及可能機制。方法:用real-time PCR檢測配對神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miR-205的表達，同時用免疫組化方法檢測配對組織中TBX18蛋白的表達量;用脂質(zhì)體將miR-205模擬物( miR-205 mimics)、miR-205抑制物( miR-205 inhibitor)以及相應(yīng)對照( control)導(dǎo)入U251膠質(zhì)瘤細胞后，Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力變化;生物信息學(xué)分析結(jié)合螢光素酶報告基因?qū)嶒炗^察miR-205對TBX18的靶向調(diào)控作用;采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)U251細胞中TBX18的表達，用Transwell實驗檢測細胞侵襲能力變化。結(jié)果: miR-205在82. 6%所檢測的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，而TBX18在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào)，兩者表達呈負相關(guān);過表達miR-205使U251細胞的侵襲細胞數(shù)下降( P＜0. 01)，抑制miR-205表達后U251侵襲細胞數(shù)增加( P＜0. 01) ; miR-205在U251膠質(zhì)瘤細胞中能直接靶向抑制TBX18的表達，干擾TBX18的表達亦使U251細胞的侵襲細胞數(shù)下降( P＜0. 01)。結(jié)論: miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，miR-205可能通過靶向調(diào)控TBX18影響膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力，這將為完善膠質(zhì)瘤侵襲的分子機制及開發(fā)新治療策略以提高膠質(zhì)瘤治療效果提供有力的理論依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］神經(jīng)膠質(zhì)瘤;微小RNA-205;腫瘤侵襲; TBX18蛋白

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率高、治愈率低，嚴重危害人類健。膠質(zhì)瘤的高侵襲性極大地限制了其綜合治療效果的提高［1］，因此，進一步探討膠質(zhì)瘤侵襲的分子機制，尋找相應(yīng)的治療靶標(biāo)具有重要意義。越來越多的研究表明microRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中及治療轉(zhuǎn)歸中的重要作用［2］，其中微小RNA-205 ( microRNA-205，miR-205)在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］及腎癌［5］等多種惡性腫瘤中存在異常表達并發(fā)揮重要功能，然而miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用有待研究。本課題將從組織及細胞水平探討miR-205神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用及可能機制。

材料和方法

1細胞與試劑

U251人膠質(zhì)瘤細胞系購于中國科學(xué)院細胞庫。23例膠質(zhì)瘤及配對組織miRNAs的cDNA文庫由本室保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco; miR-205及U6特異性引物、miRNA實時定量PCR試劑、miR-205模擬物( miR-205 mimics)及相應(yīng)對照( mimics-control)購自QIAGEN; Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、realtime PCR檢測試劑及Oligofectamine購自Invitrogen; PCR引物及DNA片段由上海英濰捷基公司合成; Transwell試劑盒購自BD; TBX18 siRNA及相應(yīng)control、鼠抗人TBX18及β-actin的I抗和羊抗鼠IgGHRP II抗為Santa Cruz產(chǎn)品。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染U251細胞在37℃、5% CO2的條件下于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天將U251細胞接種于6孔板，當(dāng)細胞長到50%～70%融合后，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，按照操作說明用Lipofectamine 2000將miR-126 mimics及其相應(yīng)對照，或TBX18 siRNA及其相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染入U251細胞，轉(zhuǎn)染5 h后，將無血清培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的常規(guī)DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，抽提RNA或蛋白以檢測相關(guān)分子的表達變化，或行Transwell實驗檢測細胞侵襲能力變化。

2.2Real-time PCRTrizol一步法提取細胞總RNA，取2 μg總RNA，按照Fermentas Revert Aid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟說明進行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增目的基因，用于real-time PCR擴增的內(nèi)參照基因GAPDH上、下游引物序列分別為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’和5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’; TBX18上、下游引物序列分別為5’-TTCTGGCGACCATCACTACG-3’和5’-ACGCCATTCCCAGTACCTTG-3’;行miRNA的real-time PCR時以U6為內(nèi)參照，結(jié)果以2－ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)，計算表達差異，實驗重復(fù)3次。

2.3Transwell實驗將包裝有Transwell小室的包裝盒從－20℃中取出放置室溫復(fù)溫，取出小室放入24孔板中，分別向小室的上、下室加入0. 5 mL已在細胞培養(yǎng)箱中預(yù)暖的培養(yǎng)基后，放置于細胞培養(yǎng)箱中進行水化2 h，水化后，小心吸棄上、下室里的液體。消化細胞制備5×107/L的細胞懸液。吸取0. 5 mL的完全培養(yǎng)基于24孔板內(nèi)，將水化后的小室小

心轉(zhuǎn)移到含有完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。吸取0. 5 mL的細胞懸液于小室內(nèi)，于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，吸棄上、下室里的液體，用棉簽小心擦凈Transwell膜上室面的細胞，用PBS洗滌3次，將遷移到膜下室面的細胞用冰預(yù)冷的甲醇固定30分鐘，用1%結(jié)晶紫被染色10 min，于流動水中漂洗，直至多余的結(jié)晶紫洗干凈，晾干后于顯微鏡下觀察并拍照記錄結(jié)果。

2.4Western blot實驗細胞用冰預(yù)冷的PBS漂洗3遍，加入含cocktail蛋白酶抑制劑的RAPI蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min;吸取裂解混合液，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清即為細胞總蛋白。測定總蛋白濃度后按每孔40 μg進行10% SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入稀釋后的TBX18 ( 1∶1 000)和β-actin( 1∶3 000) I抗，4℃孵育過夜，PBST洗滌后加HRP標(biāo)記的II抗室溫孵育1 h，ECL底物顯色。

2.5報告基因?qū)嶒瀸⒑铣珊蠸pe I和Hind III酶切位點及miR-205結(jié)合位點的TBX18-3’UTR正、反鏈DNA片段，以及缺失miR-205結(jié)合位點的正、反鏈DNA片段退火形成雙鏈后克隆入pMir-Report報告基因載體，分別獲得野生型報告基因載體( pMir-Wt)和突變型報告基因載體( pMir-Mut)，野生型正、反鏈DNA序列分別為: 5’-ctagtTATAAAATGTACATATAATAGAAAATGAAGGCTCACTGGGTTTTTTGACTTTATa-3’和5’-agcttATAAAGTCAAAAAACCCAGTGAGCCTTCATTTTCTATTATATGTACATTTTATAa-3’;突變型正、反鏈DNA序列分別為: 5’-ctagtTATAAAATGTACATATAATAGAAA……CTCACTGGGTTTTT -TGACTTTA Ta-3’和5’-agcttATAAAGTC-AAAAAACCCAGTGA……TTTCTATTATATGTAC-ATT-TTATAa-3’。按每孔5 000個把U251細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后，將miR-205 mimics和control分別與野生型或突變型報告基因載體及pRL-TK用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染U251細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，用雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒( Promega)于多功能酶標(biāo)儀上檢測螢光素酶的活性，每組3個復(fù)孔，以pRL-TK活性為內(nèi)對照標(biāo)化pMir-Report的活性，其中control和野生型報告基因組得到的值設(shè)為100，實驗重復(fù)3次。

2.6免疫組化實驗將23例膠質(zhì)瘤及配對組織石蠟切片放入60℃烘箱中烘烤2～4 h，二甲苯10 min 2次，無水乙醇10 min，95%乙醇10 min，75%乙醇10 min，50%乙醇10 min，ddH2O 10 min。3%的H2O2孵育10 min，ddH2O 3 min 3次，PBS浸泡5 min。將切片浸入0. 01 mol/L枸櫞酸緩沖液進行抗原熱修復(fù)，PBS 5 min 3次。5% BSA室溫封閉20 min，孵育TBX18抗體( 1∶150) 4℃過夜。PBS 3 min 3次，滴加生物素標(biāo)記的II抗，37℃孵育1 h。PBS 3 min 3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染2 min，自來水沖洗。50%乙醇5 min，75%乙醇5 min，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min，二甲苯10 min 2次。樹膠封片，顯微鏡下觀察。由2位病理醫(yī)生獨立判斷結(jié)果。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用χ2檢測，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean± SD)表示，兩組獨立樣本采用t檢驗，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 miR-205抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力

為了探討miR-205是否參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，檢測了23例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及配對正常腦組織的miR-205的表達情況，發(fā)現(xiàn)相比于正常配對組織，miR-205在19例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)2倍以上，即miR-205在82. 6%所檢測膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)( P＜0. 01)。既然miR-205在膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，為了觀察miR-205在膠質(zhì)細胞中的作用，通過將miR-205的mimics導(dǎo)入U251膠質(zhì)瘤細胞，相比于control，mimics轉(zhuǎn)染后miR-205的表達上調(diào)了7. 48倍( P＜0. 01)，同時發(fā)現(xiàn)miR-205過表達明顯抑制了U251細胞的侵襲能力，miR-205過表達使U251細胞的侵襲細胞數(shù)下降( P＜0. 01)。轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor至U251膠質(zhì)瘤細胞，與對照組相比，miR-205的表達量下調(diào)72. 35%( P＜0. 01)，Transwell實驗顯示抑制miR-205表達后U251侵襲細胞數(shù)增加( P＜0. 01)，見圖1。

Figure 1.Downregulation of miR-205 was observed in the glioma tissues and miR-205 inhibited glioma cell invasion.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs normal;##P＜0. 01 vs mimics-control;△△P＜0. 01 vs inhibitor-control.圖1　miR-205在膠質(zhì)瘤組織中低表達且抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力

2miR-205直接靶向調(diào)控TBX18的表達

miRNAs一般通過調(diào)控其靶基因的表達來實現(xiàn)生物學(xué)功能，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TBX18 mRNA 3’UTR的116～122位置有一個在物種間保守的miR-205種子區(qū)結(jié)合位點。在配對膠質(zhì)瘤組織和正常組織中檢測TBX18的表達量，免疫組化實驗顯示TBX18在膠質(zhì)瘤組織中的表達量顯著高于其在配對正常組織中的表達量。同時發(fā)現(xiàn)將miR-205 mimics導(dǎo)入U251細胞后，TBX18的表達在mRNA水平無明顯改變，而在蛋白水平明顯下調(diào)。為了提供miR-205通過其種子區(qū)與TBX18的3’UTR互補結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控TBX18表達的直接證據(jù)，報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，U251細胞中，相比于對照，miR-205能明顯抑制含有野生型結(jié)合位點報告基因的活性，使報告基因的活性下降了約63. 6%，而缺失結(jié)合位點的突變型則能取消miR-205對報告基因活性的抑制作用，提示TBX18是miR-205的直接調(diào)控靶標(biāo)，見圖2。

Figure 2.miR-205 directly targeted TBX18 in the U251 cells.A: schematic of predicted miR-205 binding site in the 3'UTR of human TBX18 mRNA，which was broadly conserved among vertebrates; B: immunohistochemical assay showed that TBX18 was significantly overexpressed in the glioma tissues compared with the normal tissues; C: restoring miR-205 expression with miR-205 mimics repressed TBX18 expression at protein level but not at mRNA level; D: miR-205 suppressed the activity of luciferase linked by the 3'UTR of TBX18.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs normal;##P＜0. 01 vs mimics control;△△P＜0. 01 vs pMir-Wt.圖2　miR-205在U251細胞中直接靶向調(diào)控TBX18

3下調(diào)TBX18表達抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力

為了觀察TBX18是否參與了膠質(zhì)瘤細胞的侵襲，我們通過siRNA技術(shù)下調(diào)TBX18的表達，發(fā)現(xiàn)3 號siRNA-TBX18( si-3#)能明顯下調(diào)U251細胞中TBX18的蛋白表達，故在后續(xù)實驗中將采用si-3#干擾TBX18的表達。干擾TBX18表達后，U251細胞的侵襲能力明顯降低，侵襲細胞數(shù)下降( P＜0. 01)，見圖3。

Figure 3.TBX18 was upregulated in the glioma tissues，and downregulation of TBX18 inhibited U251 glioma cells invasion.Mean± SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs control.圖3　TBX18在膠質(zhì)瘤組織中高表達且下調(diào)其表達將抑制U251細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力

討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率約為5/100 000，膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，在腫瘤周圍2 cm以內(nèi)的正常腦組織中均可能有腫瘤細胞生長，因而惡性腦膠質(zhì)瘤形成的早期就具有很強的彌散能力，所以即使手術(shù)幾乎全切強化瘤組織后，仍不能避免其在術(shù)腔邊緣的復(fù)發(fā)，手術(shù)很難完全切除，化療和放療既不能高度特異性地殺傷膠質(zhì)瘤細胞，治療效果差，又可能產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒、副作用。所以即便采用綜合治療，其預(yù)后仍很差，中位生存期仍極不理想［6］，上述情況在近30年的臨床實踐中未得到根本改善，因此腦膠質(zhì)瘤仍是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難治性疾病，闡明其發(fā)病機理、尋找新的有效的治療靶點仍然是神經(jīng)外科的熱點與難點。

miRNA是近年來生命科學(xué)界研究的熱點，越來越多的證據(jù)表明，miRNA作為表觀遺傳調(diào)控的方式之一，很可能在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中起到了重要作用，從而為腫瘤等疾病的基因診斷與治療提供了新的突破口［2］，尤其是在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面具有非常重要的診治價值［7］。至于miRNAs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中作用，目前亦有所報道，如miR-106b-5p通過靶向調(diào)控多個抑癌基因而促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤的成瘤能力［8］，miR-195靶向抑制cyclin D1和cyclin E1而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖［9］。本課題研究發(fā)現(xiàn)miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達明顯低于配對正常組織，過表達miR-205則能明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力，提示miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中可能起著抑癌基因的功能。miR-205基因位于染色體1q32. 2，自從發(fā)現(xiàn)與腫瘤的關(guān)系以來，由于在特定腫瘤中miR-205能靶向特定的基因表達，既能靶向癌基因，又能靶向抑癌基因，故顯示出了抑癌或促癌的雙重功能［10］。盡管發(fā)現(xiàn)在小鼠乳腺上皮細胞中miR-205靶向抑癌基因PTEN可能促進了腫瘤的起始［11］，然而更多報道指出miR-205在三陰性乳腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞或組織中表達明顯下調(diào)，通過靶向調(diào)節(jié)HER3、ZEB1及ZEB2等的表達而抑制乳腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移［12］，提示了miR-205在乳腺癌中作用的具有細胞或組織特異性;目前為此，大部分報道m(xù)iR-205在前列腺癌細胞和組織中表達下調(diào)，miR-205能通過維持基底膜和抑制MAPK信號通路而抑制前列腺癌的起始、進展和侵襲轉(zhuǎn)移，并且與預(yù)后呈負相關(guān)［4］。本課題首次發(fā)現(xiàn)了miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲中的作用，至于其作用機制，發(fā)現(xiàn)miR-205能直接靶向調(diào)控TBX18的蛋白表達，干擾下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中TBX18的表達亦能明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力，顯示出與過表達miR-205相似的效果。

TBX18作為轉(zhuǎn)錄因子，目前的研究主要集中于心臟的發(fā)育。Wu等［13］的研究報道TBX18在前心外膜細胞中高表達，控制著冠狀血管發(fā)育的早期步驟，Takeichi等［14］的研究發(fā)現(xiàn)TBX18通過上調(diào)心外膜細胞中Slug的表達而誘導(dǎo)心外膜細胞的EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)進程增加細胞遷移能力而進入心臟，在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)TBX18在成年小鼠心外膜細胞中呈現(xiàn)低表達，而當(dāng)心臟損傷后，心外膜細胞中TBX18的表達明顯上調(diào)，動員心外膜細胞分化心肌細胞等參與心臟的損傷修復(fù)［15］，這些研究成果驗證了TBX18在心臟發(fā)育中的重要作用。根據(jù)文獻報道參與早期發(fā)育的細胞進程或基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，如EMT進程及其相關(guān)調(diào)節(jié)基因，本課題首次發(fā)現(xiàn)了TBX18參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲作用，而至于其具體分子機制，如是否參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞的EMT進程有待進一步研究。

綜上所述，本課題研究發(fā)現(xiàn)miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，上調(diào)miR-205的表達能明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力，在膠質(zhì)瘤細胞中TBX18是miR-205的直接靶基因且下調(diào)TBX18表達亦能明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。本課題的研究將為完善神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲的分子機制及以miR-205/TBX18軸為靶的分子干預(yù)以提高膠質(zhì)瘤治療效果的治療策略開發(fā)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

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miR-205 inhibits invasion of glioma cells via targeting TBX18

ZHENG Guo-pei，JIA Xiao-ting，PENG Cong，HE Zhi-min
( Cancer Research Center，Affiliated Tumor Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China.E-mail: hezhimin2005@ yahoo.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the expression pattern of microRNA-205 ( miR-205) in glioma tissues and its role in the invasion of glioma cells.METHODS: The expression of miR-205 and TBX18 was detected by real-time PCR and immunohistochemical observation，respectively.Transwell assay was used to examine the invasion change of U251 glioma cells after miR-205 overexpression via miR-205 mimics or decrease in miR-205 expression by miR-205 inhibitor.The target of miR-205 was searched by bioinformatics analysis combined with experimental analysis.The protein level of TBX18 was determined by Western blotting after siRNA transfection and Transwell assay was conducted.RESULTS: miR-205 expression was downregulated in 82. 6% of detected glioma tissues and TBX18 was significantly overexpressed in glioma tissues compared with normal tissues.miR-205 overexpression remarkably inhibited the invasion potential of U251 glioma cells with a decrease in the invasive cells ( P＜0. 01)，while inhibition of miR-205 significantly enhanced the invasion ability of U251 cells.Mechanically，miR-205 directly targeted TBX18 and downregulation of TBX18 also significantly inhibited the invasion potential of U251 cells with a decrease in the invasive cells ( P＜0. 01).CONCLUSION: miR-205 expression is decreased in glioma，and miR-205 inhibits glioma cell invasion via targeting TBX18.Our research contributes to the mechanisms responsible for glioma invasion and provides theoretical base for developing new therapeutic strategy to treat glioma.

［KEY WORDS］Glioma; MicroRNA-205; Neoplasm invasion; TBX18 protein

通訊作者△Tel: 020-66673666; E-mail: hezhimin2005@ yahoo.com

*［基金項目］2014年廣州市屬高校科研項目( No.1201430498)

［收稿日期］2015-03-16［修回日期］2015-05-08

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1219-06

［中圖分類號］R730. 23

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.012