張福杰，戚超，趙夏，邢明磊，畢昆巍，于騰波

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東 青島 266003)

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神經(jīng)營養(yǎng)素-3基因轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞及其表達

張福杰，戚超，趙夏，邢明磊，畢昆巍，于騰波

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東 青島 266003)

目的 用神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)基因轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞并檢測其表達情況。方法 小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化后，分為非轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組，非轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，空轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組分別將空質(zhì)粒pcDNA3.1及真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1/NT-3轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞。然后經(jīng)過G418篩選后，采用RT-PCR方法檢測3組小膠質(zhì)細(xì)胞中的NT-3 mRNA水平，酶聯(lián)免疫吸咐法(ELISA法)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液的吸光度值及NT-3蛋白的濃度。結(jié)果 RT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染組可得到一250 bp的基因片段。ELISA法檢測顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液的吸光度值明顯高于非轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組，差異有顯著性(F=57.23，t=14.28、12.93，P<0.05)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液NT-3蛋白濃度亦明顯高于非轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組，差異有顯著性(F=49.56，t=15.32、11.47，P<0.05)。結(jié)論NT-3基因成功轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞，并獲得高效表達。

神經(jīng)營養(yǎng)素-3；轉(zhuǎn)染；小膠質(zhì)細(xì)胞

神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的重要一員，是一種相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)，廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化過程中起重要作用，而且對于損傷神經(jīng)元的軸突再生和功能恢復(fù)起著至關(guān)重要的作用[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種，它相當(dāng)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或炎癥時增殖并聚集于受損部位，發(fā)揮神經(jīng)保護和神經(jīng)損傷的雙重作用[2]。本實驗通過脂質(zhì)體介導(dǎo)真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞的方式將NT-3基因轉(zhuǎn)入小膠質(zhì)細(xì)胞，并檢測小膠質(zhì)細(xì)胞中NT-3基因的表達水平，為將來轉(zhuǎn)基因小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷治療的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

妊娠Fisher大鼠(青島市藥檢所)，真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1/NT-3(北京賽百盛生物工程公司)，細(xì)胞培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，胰蛋白酶、G418(Sigma公司)。

1.2實驗方法

1.2.1小膠質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化 取妊娠Fisher大鼠，無菌條件下取出胚胎，在解剖顯微鏡下將胚鼠顱骨剝?nèi)ィ暾〕鎏ツX，去除腦膜和血管，用PBS緩沖液沖洗后剪去腦干，僅留大腦半球和大腦(胼胝體予以保留)。腦組織轉(zhuǎn)移至小瓶中剪碎，反復(fù)輕柔吹打，經(jīng)胰酶消化后將濾液注于離心管，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液終止消化，離心10 min棄去上清液，沉淀物靜置30 min，以差速貼壁去除成纖維細(xì)胞。吸取細(xì)胞懸液20 mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)24 h。用D-Hanks溶液配制鹽酸利多卡因注射液至濃度為12 mmol/L，調(diào)整pH至7.3待用。吸除混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入已配制的鹽酸利多卡因溶液，繼續(xù)培養(yǎng)10 min，輕輕搖晃2 min，顯微鏡下觀察見大量細(xì)胞懸浮后，離心收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)至第2天，完全換液一次，去除未貼壁的細(xì)胞，即獲得純化的小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.2脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)NT-3轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞 將分離純化的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，重懸于培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L。取2 mL轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞融合達到80%。將4 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1/NT-3及10 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000分別加入至250 mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，獲得溶液A、B。將A、B液混勻后置于室溫下 20 min，將用PBS緩沖液再次洗滌的細(xì)胞均勻滴加于細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下培養(yǎng)24 h。用G418對培養(yǎng)液進行篩選，每4 d換液一次，共篩選3次。存活細(xì)胞培養(yǎng)、增殖后進行檢測。以未經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞(非轉(zhuǎn)染組)及空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞(空轉(zhuǎn)染組)作為對照。

1.3檢測指標(biāo)及方法

1.3.1小膠質(zhì)細(xì)胞NT-3 mRNA水平檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法。提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1/NT-3轉(zhuǎn)染后的小膠質(zhì)細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組)總mRNA，用Invitrogen試劑盒進行RT-PCR，94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。以同樣的方法測定非轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組的NT-3 mRNA水平。

1.3.2NT-3蛋白的分泌情況檢測 采用酶聯(lián)免疫吸咐法(ELISA法)。3組小膠質(zhì)細(xì)胞用胰酶消化后，按每個培養(yǎng)皿5×105個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)分別接種到8個培養(yǎng)皿中，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL，然后在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下培養(yǎng)24 h。取3組細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA檢測儀測定吸光度值及NT-3蛋白濃度。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1各組小膠質(zhì)細(xì)胞NT-3 mRNA水平比較

RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組NT-3 mRNA表達呈陽性，可擴增得到一約250 bp的條帶，而非轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)染組NT-3 mRNA表達呈陰性(圖1)。

M：Marker；A、B、C分別為非轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組β-actin；D：非轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞NT-3 mRNA；E：空轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞NT-3 mRNA；F：轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞NT-3 mRNA。

2.2各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NT-3蛋白的分泌情況

ELISA檢測結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液的吸光度值分別為0.59±0.02、0.60±0.03、2.49±0.09，轉(zhuǎn)染組高于非轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組，差異有顯著意義(F=57.23，t=14.28、12.93，P<0.05)；非轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)染組之間比較差異無顯著性(t=1.12,P>0.05)。3組細(xì)胞培養(yǎng)液的NT-3蛋白濃度分別為(3.93±0.35)、(4.12±0.27)、(15.56±1.05)ng/L，非轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)染組之間比較差異無顯著性(t=1.56,P>0.05)；轉(zhuǎn)染組高于非轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組，差異有顯著性(F=49.56，t=15.32、11.47，P<0.05)。

3 討 論

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷，給家庭和社會造成巨大的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[3]。脊髓損傷后的功能修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界的難題，目前人們也在致力于尋求有效的治療方法攻克這一難題。脊髓損傷后的病理改變有神經(jīng)元損傷、軸突中斷及出血等，近年來研究顯示脊髓損傷后功能恢復(fù)差的一個重要原因就是神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏，而其中NT-3的缺乏是一個不可忽視的因素。

NT-3是中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元發(fā)育、分化、存活和再生的重要營養(yǎng)因子。NT-3分泌后能通過p75NTR和Trks受體激活其下游信號通路，促進軸突生長和血管再生，因此，NT-3在脊髓損傷后的功能恢復(fù)方面發(fā)揮重要作用[4]。WEISHAUPT等[5]研究結(jié)果顯示，脊髓損傷后NT-3基因表達明顯增加，從而有利于脊髓損傷的修復(fù)。NT-3可刺激神經(jīng)前體細(xì)胞分化為新的神經(jīng)元，并促進神經(jīng)元的存活，還可通過提高細(xì)胞Ca2+平衡能力和自由基清除能力，減輕局部缺血及自由基造成的神經(jīng)元損傷。ZHANG等[6]研究表明，NT-3可以通過抵御中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺血性或再灌注性損傷，發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，生理條件下處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，小膠質(zhì)細(xì)胞可經(jīng)過多種信號途徑，如PTK途徑、PLA2途徑、MAPK超家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被迅速激活，引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，同時發(fā)揮巨噬細(xì)胞的吞噬作用，參與炎癥、損傷等病理過程。它可以吞噬壞死的細(xì)胞及髓鞘，滅活細(xì)胞裂解后釋放的毒性物質(zhì)，為神經(jīng)元提供一個相對適合的微環(huán)境，促進組織修復(fù)。小膠質(zhì)細(xì)胞在激活T淋巴細(xì)胞同時，還可激活中性粒細(xì)胞及其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，促進細(xì)胞因子和生長因子的分泌，從而有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷組織的再生[7]。于騰波等[8]研究證明，小膠質(zhì)細(xì)胞移植可以促進脊髓損傷大鼠后肢運動功能的恢復(fù)。

目前，脊髓損傷治療的研究中，基因修飾的細(xì)胞移植漸成主流。WANG等[9]報道，NT-3基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可促進脊髓功能的恢復(fù)。施新革等[10]應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)NT-3轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞，結(jié)果顯示NT-3基因成功轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞并高效表達。因此，本文嘗試將NT-3基因轉(zhuǎn)入小膠質(zhì)細(xì)胞，研究其在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達情況。

本實驗RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞NT-3 mRNA水平明顯升高，表明轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞NT-3基因在轉(zhuǎn)錄水平上獲得良好表達；ELISA法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液吸光度值及NT-3蛋白濃度顯著增加，表明轉(zhuǎn)染組小膠質(zhì)細(xì)胞可高效表達NT-3蛋白。本實驗從基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上檢測NT-3基因的表達情況，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，NT-3基因成功轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞，并獲得了高效表達，從而為進一步將NT-3基因修飾的小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷的治療提供了實驗依據(jù)。但是，NT-3基因修飾的小膠質(zhì)細(xì)胞移植到脊髓損傷部位后，對受損脊髓功能恢復(fù)的作用還需要進一步的研究。

[1] LYKISSAS M G, BATISTATOU A K, CHARALABOPOULOS K A, et al. The role of neurotrophins in axonal growth, guidance, and regeneration[J]. Current Neurovascular Research, 2007,4(2):143-151.

[2] 安海勇,程光,白俊清. 小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷作用機制的研究進展[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2013,10(9):31-33,39.

[3] 孫中儀,陳伯華,胡有谷,等. 中國脊柱脊髓損傷數(shù)據(jù)庫對急性脊髓損傷病人的分析價值[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2012,48(2):115-117.

[4] 張冉,龍雙漣. 神經(jīng)營養(yǎng)素-3及其在脊髓損傷修復(fù)中的作用[J]. 中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志, 2013,41(2):196-200,210.

[5] WEISHAUPT N, MASON A L, HURD C, et al. Vector-induced NT-3 expression in rats promotes collateral growth of injured corticospinal tract axons far rostral to a spinal cord injury[J]. Neuroscience, 2014,272:65-75.

[6] ZHANG J, SHI Q, YANG P, et al. Neuroprotection of neurotrophin-3 against focal cerebral ischemia/reperfusion injury is regulated by hypoxia-responsive element in rats[J]. Neuroscience, 2012,222:1-9.

[7] LOANE D J, BYRNES K R. Role of microglia in neurotrauma[J]. Neurotherapeutics: the Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, 2010,7(4):366-377.

[8] 于騰波,寇德偉,程永帥,等. 活化小膠質(zhì)細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的療效初探[J]. 中華創(chuàng)傷雜志, 2008,24(5):373-377.

[9] WANG L J, ZHANG R P, LI J D. Transplantation of neurotrophin-3-expressing bone mesenchymal stem cells improves recovery in a rat model of spinal cord injury[J]. Acta Neurochirurgica, 2014,156(7):1409-1418.

[10]施新革,宗海斌,董玉珍,等. 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子-3在大鼠雪旺細(xì)胞中的表達[J]. 軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報, 2011,32(9):956-958,964.

(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

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TANSFECTION OF NEUROTROPHIN-3 GENE TO MICROGLIA AND ITS EXPRESSION

ZHANGFujie,QIChao,ZHAOXia,XINGMinglei,BIKunwei,YUTengbo

(Department of Orthopedics, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo transfect neurotrophin-3 (NT-3) gene into microglia and test its expression.MethodsMicroglia were separated, purified and randomized to three groups as non-transfection group, empty-transfection group, transfection group. In non-transfection group, the microglia were not transfected by plasmid, and in empty-transfection group and transfection group, pcDNA3.1 and pcDNA3.1/NT-3 were transfected to microglia, respectively. After G418 screening, the level of NT-3 mRNA in microglia in the three groups was detected using RT-PCR, and the absorbance and NT-3 protein concentration in each group were measured employing enzyme-linked immunoassay sensitive assay (ELISA).ResultsRT-PCR showed a 250 bp segment obtained in the transfection group. ELISA showed that the absorbance in the cell culture fluid in transfection group was higher than that in both non-transfection and empty-transfection groups (F=57.23;t=14.28,12.93;P<0.05), and NT-3 protein concentration was also higher (F=49.56;t=15.32,11.47;P<0.05).ConclusionNT-3 gene was successfully transfected to microglia, and obtained efficient expression.

neurotrophin-3; transfection; microglia

2015-04-29;

2015-08-26

青島市民生計劃項目(13-1-3-26-nsh)

張福杰(1990-)，男，碩士研究生。

于騰波(1970-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。

Q784

A

1008-0341(2015)06-0661-03