徐東明 ,張馳,張希泉,趙洪霞

1.哈爾濱鐵路疾病預(yù)防控制中心,黑龍江哈爾濱 150081;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154002

正常人體中的腸道中,分布有多種益生菌、條件致菌病和少數(shù)致病菌,這些病菌能夠發(fā)揮拮抗病原微生物定植、刺激機(jī)體免疫機(jī)制等的作用,進(jìn)而維持腸道的正常結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能。腸道菌群如果失調(diào),就可能引起一系列的腸外疾病,2型糖尿病、肥胖等都是腸道菌群失調(diào)可能誘發(fā)的疾病[1]。該研究就該院收治的2型糖尿病患者作為研究對象,通過實(shí)時(shí)定量PCR法對其腸道乳酸桿菌菌種數(shù)量的變化進(jìn)行分析,并探討其對患者的血糖、血脂代謝的影響。具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在該院收治的2型糖尿病患者100例作為研究對象,所有患者均符合世界衛(wèi)生組織制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)[2]：合并肝腎功能損傷的患者；合并甲狀腺疾病及其他內(nèi)分泌疾病的患者；合并腫瘤的患者；近期(4周內(nèi))有使用胃腸道相關(guān)治療藥物或者抗生素、微生態(tài)制劑的患者；近3個(gè)月內(nèi)有使用降脂藥物的患者。其中,男性患者52例,女性患者48例,其年齡在35~78歲之間,平均年齡為(57.9±3.3)歲。

選擇同期在該院接受健康體檢的正常人100例作為研究對象,男女各50例,年齡在33～78歲之間,平均年齡為(56.2±3.6)歲。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)者血糖、血脂水平的比較(x-±s)

表2 兩組實(shí)驗(yàn)者總?cè)樗釛U菌及具體菌屬的數(shù)量比較(Xlgx± Slgx拷貝數(shù)/克濕便)

兩組實(shí)驗(yàn)者的性別、年齡等方面的比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

采集兩組實(shí)驗(yàn)者的空腹血液標(biāo)本和餐后2 h血液標(biāo)本,分別對其空腹血糖值、糖化血紅蛋白水平、血脂相關(guān)指標(biāo)(血清總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白以及甘油三酯等)以及餐后2 h血糖值等指標(biāo)進(jìn)行測定和比較。

采集實(shí)驗(yàn)者的糞便樣品,保存在零下70 ℃的環(huán)境中,對其進(jìn)行預(yù)處理和細(xì)菌總DNA提取。稱取濕重糞便樣品,加滅菌PBS振蕩混合后做離心處理,采集上清液(菌體)并反復(fù)洗滌后再次離心,收集沉淀中的菌體,以滅菌PBS懸浮,離心并多次洗滌后保存獲得的菌體沉淀。嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒上的操作要求對菌體沉淀中的細(xì)菌總DNA進(jìn)行提取,行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析后將細(xì)菌DNA溶液置于零下20 ℃的條件下保存。

參照文獻(xiàn)[3],根據(jù)乳酸桿菌菌種的16s rRNA基因序列,設(shè)計(jì)特異性PCR引物。將標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR產(chǎn)物依次進(jìn)行切膠和回收處理后得到的DNA片段作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)時(shí)的熒光擴(kuò)增信號(hào),獲取乳酸桿菌菌種的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取到糞便樣品DNA分別進(jìn)行乳酸桿菌總屬及其具體菌種16s rRNA熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系、條件等一致。將糞便細(xì)菌的DNA樣品和10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)做實(shí)時(shí)PCR反應(yīng),每個(gè)樣品做2個(gè)平行復(fù)孔,在反應(yīng)結(jié)束之后通過融解曲線的分析判斷PCR產(chǎn)物的特異性,并計(jì)算單位量糞便樣品中待測細(xì)菌基因的拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

該次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,其中計(jì)量資料對比采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料對比采用c2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

比較糖尿病患者和健康志愿者的血糖、血脂等主要觀察指標(biāo)的區(qū)別,可見糖尿病患者各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于健康志愿者,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

比較糖尿病患者和健康志愿者的乳酸桿菌菌屬及具體菌種的數(shù)量,可見除植物乳桿菌外,總?cè)樗釛U菌及嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌的比較,兩組實(shí)驗(yàn)者均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

對乳酸桿菌數(shù)量與血糖、血脂各項(xiàng)指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行分析,可見其與血脂各項(xiàng)指標(biāo)均成負(fù)相關(guān),但與低密度脂蛋白膽固醇之間的相關(guān)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

作為腸道中普遍存在益生菌,乳酸桿菌包括了嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等多種菌種,其在維持腸道正常結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能上發(fā)揮重要作用,但對人體代謝機(jī)制的影響并不十分清晰。

實(shí)時(shí)定量PCR法能對目標(biāo)細(xì)菌16s rRNA V3區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物,并通過熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測樣本,特異性高。該文經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR法對2型糖尿病患者和健康志愿者腸道內(nèi)的乳酸桿菌菌種數(shù)量進(jìn)行了測定和比較,結(jié)果可見2型糖尿病患者的總?cè)樗釛U菌以及嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等具體菌種的數(shù)量均顯著增加,與正常人比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而將其與實(shí)驗(yàn)者的血糖、血脂水平進(jìn)行相關(guān)性分析,則可見其改變與血脂水平呈負(fù)相關(guān),提示長期高脂飲食可能是造成腸道菌群失調(diào),代謝紊亂,誘發(fā)2型糖尿病的原因之一。腸道菌群無法正常轉(zhuǎn)化不溶性糖類和蛋白質(zhì)而將葡萄糖分解為乳酸,參與膽固醇代謝,進(jìn)而導(dǎo)致2型糖尿病。這也提示在對患者進(jìn)行治療的時(shí)候可以通過飲食調(diào)節(jié)乳酸桿菌菌種數(shù)量改善患者的血糖、血脂代謝失調(diào)。

[1] 宋美茹,姚萍. 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 定量檢測潰瘍性結(jié)腸炎腸道大腸埃希菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌屬的變化[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2012,24(3):239-241.

[2] 唐源淋,張紹衡,郭亞兵,等. 兩種方法定量分析肝硬化患者腸道菌群改變的比較[J]. 現(xiàn)代消化及介入診療,2012,17(1):5-7.

[3] 劉婷婷, 蔡德鴻. 實(shí)時(shí)定量PCR法分析2型糖尿病患者腸道乳酸桿菌菌種數(shù)量的改變[J]. 世界華人消化雜志,2012,20(15):1359-1362.