郭麗麗 郭勝利 郭煒 董稚明 郭艷麗

[摘要] 目的 通過對食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織中含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶18（ADAMTS18）mRNA及蛋白表達情況的檢測，探討ADAMTS18在ESCC發(fā)生、發(fā)展中所起的作用及臨床意義，為ESCC的臨床早期診斷及預后評估提供新的客觀參考指標。 方法 采用半定量-逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）的方法及免疫組化S-P的方法（生物素-鏈霉卵白素過氧化酶系統(tǒng)）對72例ESCC組織及癌旁正常組織中ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達進行檢測。 結果 ①ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的相對表達量為（0.361±0.115），在癌旁正常組織中表達量為（0.879±0.265），ESCC組織中ADAMTS18 mRNA表達量顯著低于癌旁正常組織（P < 0.01）；ADAMTS18 mRNA在高/中分化鱗癌組中的相對表達量為（0.496±0.153），在低分化鱗癌組中為（0.232±0.088），低分化鱗癌組ADAMTS18 mRNA表達量顯著低于高/中分化鱗癌組（P < 0.05）。②ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的陽性表達率為34.7%（25/72），在癌旁組織中的陽性表達率為93.1%（67/72），ADAMTS18蛋白在ESCC組織中陽性表達率顯著低于癌旁組織（P < 0.01）；ADAMTS18蛋白在高/中分化鱗癌組中的陽性表達率為45.4%（20/44），在低分化鱗癌組中為17.8% （5/28），低分化鱗癌組ADAMTS18蛋白陽性表達率顯著低于高/中分化鱗癌組（P < 0.05）。 結論 ADAMTS18基因在ESCC中的異常表達與ESCC的發(fā)生、發(fā)展及組織分化程度關系密切，檢測ESCC組織中ADAMTS18基因的表達情況，有助于ESCC早期診斷及預后評估。

[關鍵詞] 食管鱗狀細胞癌；ADAMTS18；表達

[中圖分類號] R735.102 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（a）-0076-04

食管癌（esophageal carcinoma，EC）屬于上消化道常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)食管癌人數(shù)約40萬例，死亡約30萬例，其中我國食管癌發(fā)病率和病死率在全球位居首位[1]。目前迫切需要對食管癌發(fā)病原因及機制進行深入研究，從而尋求敏感、特異的早期診斷指標和治療方法。含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS）家族的蛋白水解功能可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲有關。該家族不同成員在不同來源腫瘤的發(fā)生中所起的作用也不盡相同。國內外對ADAMTS18基因的表達與食管癌的關系罕見報道。本實驗通過對食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）組織及癌旁正常組織中ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達進行檢測，探討ADAMTS18與ESCC發(fā)生、發(fā)展的相關性及其生物學意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 組織標本均來自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院2008～2011年的ESCC手術患者，共72例，其中，男53例，女19例，年齡43～76歲，平均（61.2±2.5）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，入選患者均簽署了知情同意書。按照1997年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）標準進行TNM分期（Ⅰ期2例，Ⅱ期38例，Ⅲ期29例，Ⅳ期3例）；根據(jù)有無淋巴結轉移分為有淋巴結轉移組（45例）和無淋巴結轉移組（27例）；按腫瘤組織分化程度分為高分化組（17例）、中分化組（27例）、低分化組（28例）。所有患者術前均未經(jīng)化療和放療，術中取癌旁正常黏膜組織以及ESCC原發(fā)灶組織。所有入選患者均通過胃鏡檢查診斷為食管癌，且術后病理檢查確診為ESCC，保存完整臨床病理資料及手術記錄。術中切取標本時，遵循先取癌旁組織、后取腫瘤組織的原則，切除標本一部分用于提取RNA，一部分用于制作蠟塊（HE染色及免疫組化染色）。

1.1.2 主要試劑 TRIzol（美國SBS公司）、總RNA提取試劑（美國Promega公司）、逆轉錄PCR試劑盒（美國Foments 公司）、綠色體系（美國Promega 公司）、DNA Marker（北京Solarbio科學技術有限公司）、氯仿、異丙醇（上?；瘜W試劑總廠）、瓊脂糖（西班牙進口分裝）、DEPC（美國Invitrogen公司）、EB（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）、兔抗人ADAMTS18多克隆抗體（生工生物工程有限公司）、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術開發(fā)公司）、EDTA修復液（Gene Tech公司）、DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術開發(fā)公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的表達 按照TRIzol試劑說明書低溫提取ESCC組織及癌旁組織中RNA，并參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA。ADAMTS18上游引物為5'- TGCACAACGGCAGGAAAAAG-3'，下游引物為5'-TCAAAATCGCCGAGGGCTTA-3'；GAPDH作為內參，上游引物為5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物為5'-GTGGTCGTTGAGGGCAAT-3'。RT-PCR反應條件：94℃預變性10 min，94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)擴增后，72℃ 7 min。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，ADAMTS18的PCR產物片段大小為114 bp，GAPDH為342 bp。采用Gel Pro Analysizer 3.1軟件測定ADAMTS18基因灰度值，每個細胞及組織標本均重復做3次取平均值，以內參照GAPDH的OD值標化ADAMTS18基因的OD值，從而得到相對表達強度。

1.2.2 免疫組織化學S-P法（生物素-鏈霉卵白素過氧化酶系統(tǒng)）檢測ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的表達 石蠟標本常規(guī)4 μm連續(xù)切片，進行免疫組織化學染色的切片經(jīng)脫蠟、水化后，采用3%甲醇過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，EDTA緩沖液高壓鍋抗原熱修復。一抗為兔抗人ADAMTS18多克隆抗體，加SP試劑后DAB顯色，蘇木精復染細胞核，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知平滑肌纖維組織陽性切片作為陽性對照。根據(jù)半定量標準：物鏡下陽性細胞≤10%判為1分；>10%～50%判為2分；>50%～75%判為3分；>75%判為4分。染色強度分數(shù)判斷標準：無色判為0分；淡黃色判為1分；棕黃色判為2分；棕褐色判為3分。將上述兩項得分相加：0分表示為“-”，1～2分表示為“+”，3～4分表示為“++”，5～6分表示為“+++”。以“++”或“+++”時定義為陽性表達，以“-”或“+”時定義為陰性表達。免疫組化染色結果經(jīng)兩名有經(jīng)驗的病理學醫(yī)師采用雙盲法診斷，一張切片需觀察至少5個高倍視野。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達

ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的相對表達量為（0.361±0.115），在癌旁正常組織中為（0.879±0.265），ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達量顯著低于相應癌旁正常組織，經(jīng)統(tǒng)計學分析兩者差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），見圖1。分組分析發(fā)現(xiàn)，低分化鱗癌組ADAMTS18 mRNA表達量顯著低于高/中分化鱗癌組，經(jīng)統(tǒng)計學分析兩組差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；ADAMTS18 mRNA的表達與ESCC患者的年齡、性別、有無淋巴結轉移及TNM分期均無關（P > 0.05）。見表1。

1～3：癌旁正常組織；4～6： ESCC組織；7：DNA Marker；ESCC：食管鱗狀細胞癌

圖1 食管鱗狀細胞癌組織及癌旁正常組織中

ADAMTS18 mRNA表達

表1 食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征與ADAMTS18 mRNA表達的關系（x±s）

2.2 ESCC組織中ADAMTS18蛋白的表達

ADAMTS18蛋白的陽性產物主要位于細胞質，染色均勻呈棕黃色（圖2，見封四）。72例癌旁組織中ADA MTS18蛋白陽性表達67例，陽性表達率為93.1%（67/72），72例ESCC組織中ADAMTS18蛋白陽性表達25例，陽性表達率為34.7%（25/72），ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的表達陽性率顯著低于癌旁組織，經(jīng)統(tǒng)計學分析兩者差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。分組分析發(fā)現(xiàn)，低分化鱗癌組ADAMTS18蛋白表達陽性率顯著低于高/中分化鱗癌組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；ADAMTS18蛋白表達與ESCC患者的年齡、性別、有無淋巴結轉移、TNM分期均無關（P > 0.05）。見表2。

表2 食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征與ADAMTS18蛋白表達的關系[n（%）]

3 討論

食管癌是常見的上消化道惡性腫瘤，全球統(tǒng)計其發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，病死率在惡性腫瘤病死率排名中位居第4位[1]。在世界范圍內中國是食管癌發(fā)病率及病死率最高的國家。中國人群食管癌以ESCC為高發(fā)類型，占90%以上，以40歲以上男性較多見。自20世紀中葉至今，我國在ESCC手術切除率和患者5年生存率等諸多方面取得了矚目的成就，但ESCC患者中50%已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤或者淋巴結轉移，術后2年約半數(shù)患者仍然死于轉移或復發(fā)，其預后差，遠期生存率極低，晚期ESCC的5年生存率約為15%[2]，早期ESCC的5年生存率高于90%[3]。因此，ESCC患者重在疾病的早期診斷，對參與ESCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移過程中較特異的腫瘤標志物進行研究，能夠為ESCC的早期診斷提供堅實的理論基礎，有效降低ESCC的病死率。

腫瘤相關基因發(fā)生突變或表達異常，致使機體發(fā)生惡性腫瘤，且能夠從原發(fā)腫瘤部位脫離并穿透基底膜，進一步侵襲結締組織，使惡性腫瘤轉移至鄰近組織或者遠處器官，這一系列復雜過程需要借助細胞-細胞/細胞-細胞間質間的相互作用才能完成。腫瘤細胞的侵襲轉移能力取決于其誘導產生的蛋白酶降解細胞外基質（ECM）和基底膜能力的大小，ECM和基底膜表面存在多種受體，與腫瘤細胞結合后，腫瘤細胞通過誘導宿主基質細胞大量分泌金屬蛋白酶類，并協(xié)同為腫瘤細胞浸潤、轉移創(chuàng)造有利的腫瘤微環(huán)境。其中，ADAMTS家族在腫瘤發(fā)生、浸潤、轉移過程中起著至關重要的作用。ADAMTS也稱Ⅰ型血小板結合蛋白基序的去整合素金屬蛋白酶，屬于Zn2+依賴-分泌型金屬蛋白酶超家族，包含19個基因家族成員，由平滑肌細胞、成纖維細胞以及巨噬細胞等多種細胞分泌，屬于可溶性分泌蛋白酶，其中金屬蛋白酶域以及Ⅰ型凝血酶敏感蛋白（thrombospondin type Ⅰ，TSP1）基序為其標志性結構，TSP1基序能夠介導ADAMTS結合ECM蛋白并與之發(fā)生作用[4]。據(jù)報道，ADAMTS家族成員在正常的胚胎生長發(fā)育、性腺發(fā)育、卵巢正常生理過程、炎癥發(fā)生以及結締組織病、血栓性血小板減少性紫癜、血栓形成、惡性腫瘤等人體正?；虍惓５纳砘顒又卸及缪葜匾慕巧玔5-10]。

ADAMTS18屬于全基因組關聯(lián)基因，位于人類染色體16q23，含有13個外顯子，可以編碼一個含有1222個氨基酸的蛋白質[11]。關于ADAMTS18與ESCC的關系國內外尚未見報道。本實驗采用RT-PCR及免疫組化技術檢測了72例ESCC黏膜組織及其相應癌旁正常黏膜組織中的ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達量及ADAMTS18蛋白的陽性表達率均顯著低于癌旁正常黏膜組織。推測ADAMTS18在ESCC組織中屬于抑癌基因，它的異常表達導致ESCC的發(fā)生，目前國外文獻[11-12]也有結果一致的報道，但對于ADAMTS18是如何發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長作用的機制還不甚明確。ADAMTS18可能直接作用于其他抑制因子，從而起到間接抑制腫瘤細胞生長的作用；也可能通過裂解血小板聚合物實現(xiàn)，血小板裂解產物能夠促進血管內皮細胞的生血管反應，逐漸使癌變組織細胞修復至正常組織細胞狀態(tài)。本實驗根據(jù)患者的臨床病理特征進行分組分析，ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達可能與組織分化程度關系緊密，高/中分化ESCC組ADAMTS18 mRNA相對表達量以及ADAMTS18蛋白陽性表達率均明顯高于低分化ESCC組，隨著ESCC組織分化程度逐漸下降，ADAMTS18基因的表達也隨之下調。有文獻證實，人類黑素瘤中存在著ADAMTS18基因的大規(guī)模突變及異常表達，體外實驗中ADAMTS18的基因突變能夠降低層粘連蛋白的黏附作用，從而促進黑素瘤細胞的轉移[13]。本研究證實，ADAMTS18基因的低水平表達可能會促進ESCC的發(fā)生發(fā)展，其高水平表達可能會抑制ESCC的發(fā)生發(fā)展，屬于抑癌基因。

腫瘤細胞的侵襲和轉移已成為國內外學者研究的熱點之一。ADAMTS家族成員廣泛參與機體多種重要的生理性以及病理性活動過程，例如細胞凋亡、血管新生、腫瘤發(fā)生發(fā)展等，因此對ADAMTS結構、功能以及其與人類多種疾病關系的深入研究，能夠為疾病的早期診斷、后續(xù)治療、預后評估提供堅實的理論依據(jù)和廣闊的前景。關于ADAMTS18在ESCC組織中的異常表達對腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的確切機制還有待進一步研究探討。

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（收稿日期：2014-10-15 本文編輯：程 銘）