田曉玲， 林鳳平△， 李偉民， 劉秀芬

(1咸寧市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科, 湖北科技學院 2臨床學院， 3藥學院， 湖北 咸寧 437100)

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微小RNA-19a對肝細胞LO2脂肪分解代謝的影響

田曉玲1， 林鳳平1△， 李偉民2， 劉秀芬3

(1咸寧市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科, 湖北科技學院2臨床學院，3藥學院， 湖北 咸寧 437100)

目的： 觀察微小RNA-19a(microRNA-19a, miR-19a)對肝細胞LO2脂肪分解代謝的影響，并初步探索可能機制。方法: 在肝細胞LO2中轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物(mimics)或miR-19a抑制物(inhibitor)，用實時熒光定量PCR檢測miR-19a的水平變化，利用生物信息學網(wǎng)站查找miR-19a的靶點，進而用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-19a對過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)3’UTR活性的影響，通過Western blotting法檢測PPARα及其下游脂肪分解代謝關(guān)鍵限速酶?；o酶A脫氫酶(acyl-coenzyme a dehydrogenase，ACADM)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A)蛋白水平的變化，通過β-羥丁酸(beta-hydroxybutyric acid，β-OHB)試劑盒檢測肝細胞LO2內(nèi)酮體的生成能力。 結(jié)果: 轉(zhuǎn)染miR-19a mimics可顯著升高LO2細胞中的miR-19a水平(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor可明顯抑制LO2細胞中的miR-19a水平(P<0.05)；生物信息學分析提示PPARα可能為miR-19a的潛在靶點，雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-19a mimics可使PPARα的3’UTR活性明顯降低，miR-19a inhibitor可使PPARα的3’UTR活性顯著升高，同時伴隨PPARα及其下游基因ACADM和CPT1A的蛋白水平變化。此外，miR-19a mimics明顯降低肝細胞LO2中β-OHB的含量(P<0.05)，miR-19a inhibitor可明顯上調(diào)肝細胞LO2中β-OHB的含量(P<0.05)。 結(jié)論: miR-19a可通過調(diào)控PPARα及其下游關(guān)鍵限速酶的表達，調(diào)節(jié)肝細胞的脂肪分解代謝能力。

微小RNA-19a； 過氧化物酶體增殖物激活受體α； 脂肪分解代謝

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)作為一類非編碼單鏈小RNAs，廣泛存在于人體各組織臟器中，其可通過對靶基因mRNA的穩(wěn)定性及翻譯蛋白等過程進行調(diào)控，從而影響靶基因轉(zhuǎn)錄后的表達水平。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在人類腫瘤、胚胎發(fā)育及代謝類等多種疾病中都扮演著重要作用[1-3]。微小RNA-19a (microRNA-19a，miR-19a)是miR-17-92 家族中的一員，miR-17-92家族在心、肺、血管及免疫系統(tǒng)的發(fā)育中不可或缺，也可調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]，但miR-19a在肝臟脂肪代謝中的作用尚不十分清楚。本文利用miR-19a模擬物(mimics)及抑制物(inhibitor)作為轉(zhuǎn)染人肝細胞LO2作為模型，旨在研究miR-19a對肝細胞脂肪分解代謝的影響，并初步探索其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 細胞與實驗試劑

肝細胞LO2購自中科院上海細胞庫。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid，β-OHB)檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量PCR試劑購自Invitrogen；抗過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators activated receptor α，PPARα)、抗?；o酶A脫氫酶(acyl-coenzyme a dehydrogenase, ACADM)、抗肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT1A)及抗GAPDH抗體購自CST；雙螢光素酶報告基因試劑盒購自Promega。miR-19a模擬物、抑制物及miR-19a熒光定量PCR檢測引物由廣州銳博生物科技公司設(shè)計并合成。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 將肝細胞LO2根據(jù)不同處理因素分為4組，其中轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物為過表達組(mimics組)，轉(zhuǎn)染miR-19a抑制物為低表達組(inhibitor組)，轉(zhuǎn)染無義序列的為陰性對照組(control組)，未做轉(zhuǎn)染的為空白對照組(blank組)。按照Lipofectamine 2000試劑說明書常規(guī)轉(zhuǎn)染。將20 pmol的microRNA及6 μL脂質(zhì)體分別稀釋于250 μL無血清培養(yǎng)基，室溫靜置5 min后輕柔混勻，再室溫靜置10 min后均勻加入各組培養(yǎng)板中，使microRNA的終濃度為10 nmol/L，溫箱培養(yǎng)6 h后換為完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48 h行后續(xù)實驗。

2.2 實時熒光定量PCR(real-time PCR) 收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的LO2細胞，Trizol一步法提取其中總RNA，常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用real-time PCR試劑盒擴增，ABI 7300檢測并分析細胞中miR-19a的表達水平。

2.3 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?將LO2細胞以每孔1×105的密度接種于24孔板，第2天當細胞約融合至70%時，利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染包含有PPARα的3’UTR的螢光素酶質(zhì)粒和miR-19a模擬物或抑制物，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒在多功能分類光度計上測定并分析。

2.4 Western blotting實驗 收集轉(zhuǎn)染處理48 h后的LO2細胞，加入適量RIPA裂解液，獲取細胞總蛋白液，加入適量SDS上樣緩沖液100 ℃水浴解除蛋白交聯(lián)。各組蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，然后依次孵育 I 抗4 ℃過夜及辣根過氧化物酶標記的 II 抗室溫1 h后化學發(fā)光法顯影，檢測細胞中PPARα、ACADM及CPT1A的表達情況，以GAPDH作為內(nèi)參照。

2.5 酮體生成實驗 按照上述實驗分組轉(zhuǎn)染細胞，48 h后收集各組細胞，分別計數(shù)1×106個，利用-β羥丁酸檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)的β-OHB含量代表細胞的酮體生成能力，每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 在LO2細胞中過表達或低表達miR-19a

LO2中轉(zhuǎn)染miR-19a mimics可升高LO2細胞中的miR-19a水平，mimics組顯著高于陰性對照組(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor可明顯抑制LO2細胞中的miR-19a水平，inhibitor組顯著低于陰性對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.miR-19a over-expression and low expression in LO2 cells by transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank and control.

2 miR-19a對PPARα的3’UTR活性的影響

生物信息學分析提示PPARα 可能為miR-19a的潛在靶點。通過雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-19a 能影響PPARα的3’UTR活性。miR-19a mimics可使PPARα的3’UTR活性降低約80%(P<0.05)，而miR-19a inhibitor可使PPARα的3’UTR活性升高近6倍(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect of miR-19a on the activity of PPARα 3’UTR after transfection. A: the results of bioinformatic analysis about the interaction between PPARα 3’ UTR and miR-19α; B: the effect of miR-19a on the activity of PPARα 3’UTR in LO2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank and control.

3 miR-19a對PPARα及下游蛋白的影響

干預miR-19a后，利用Western blotting實驗檢測PPARα及其下游基因ACADM和CPT1A的蛋白水平變化，結(jié)果提示，與陰性對照組及空白對照組相比，miR-19a mimics可明顯降低肝細胞LO2中PPARα及其下游ACADM和CPT1A的蛋白水平，提示過表達miR-19a可抑制PPARα為核心的脂肪代謝途徑；而轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor沉默miR-19a的表達后，PPARα及其下游ACADM和CPT1A的蛋白水平明顯增加，提示沉默miR-19a可促進脂肪代謝，見圖3。

4 miR-19a對LO2細胞酮體生成的影響

β-OHB是酮體的主要成分，代表細胞脂肪分解代謝生成酮體的能力，miR-19a mimics明顯降低肝細胞LO2中β-OHB的含量(P<0.05)；而miR-19a inhibitor明顯上調(diào)肝細胞LO2中β-OHB的含量P<0.05)，見圖4。

討 論

研究表明，miRNAs可通過結(jié)合在靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域，促進該mRNA降解或抑制mRNA翻譯形成蛋白質(zhì)。miR-17-92家族具有相似的核苷酸序列及空間結(jié)構(gòu)，可影響多種蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，目前認為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及胚胎發(fā)育器官形成等多種病理生理學進程中起重要的作用，但miR-19a作為該家族其中的一員，在細胞代謝中發(fā)揮何種功能尚不十分明確。我們通過生物信息學網(wǎng)站Targetscan對miR-19a進行分析，發(fā)現(xiàn)PPARα是在多個物種中高度符合的潛在靶點，而PPARα作為過氧化物酶體增殖物激活受體家族的重要成員，在脂代謝、糖代謝及脂蛋白合成等多個代謝信號轉(zhuǎn)導通路中起核心調(diào)控作用，一般認為，PPARα是脂肪分解代謝過程中的關(guān)鍵蛋白，其上游可以受到氧濃度、應(yīng)激、激素及糖脂水平等多種因素的調(diào)節(jié)，而PPARα可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游多個脂代謝限速酶如ACADM及CPT1A的表達[6-7]。

Figure 3.The effect of miR-19a on the protein levels of PPARα，ACADM and CPT1A in the LO2 cells after transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank and control.

我們通過轉(zhuǎn)染miR-19a的模擬物或抑制物，干預LO2細胞中miR-19a的水平，利用雙螢光素酶報告基因檢測miR-19a對PPARα的3’UTR活性的影響，證實miR-19a可以結(jié)合于PPARα的3’UTR區(qū)域，進而通過Western blotting實驗在蛋白水平上證實miR-19a可以調(diào)控PPARα及其下游ACADM及CPT1A的表達。而既往研究表明ACADM及CPT1A主要參與脂肪的分解代謝，是控制脂肪酸代謝為酮體的關(guān)鍵限速酶[8-11]，我們進而檢測細胞內(nèi)酮體主要成分之一的β-OHB的水平，同樣也發(fā)現(xiàn)miR-19a可以顯著影響LO2細胞中β-OHB的含量。

Figure 4.The effect of miR-19a on the generation of ketone body in LO2 cells after transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank and control.

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在LO2肝細胞中干預miR-19a的表達，可以通過結(jié)合于PPARα影響肝細胞脂肪的分解代謝及酮體生成。本研究初步闡明了miR-19a調(diào)控脂肪代謝的分子生物學機制，為糖尿病、脂肪肝等糖脂代謝異常類疾病的臨床治療提供了新的藥物靶點及監(jiān)測指標。

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Effect of miR-19a on lipid catabolism in hepatocyte LO2

TIAN Xiao-ling1, LIN Feng-ping1, LI Wei-min2, LIU Xiu-fen3

(1DepartmentofEndocrinology,XianningCentralHospital,2DepartmentofInternalMedicine;3DepartmentofPharmacology,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning437100,China.E-mail:lin3126@126.com)

AIM: To observe the effect of microRNA-19a (miR-19a) on the lipid catabolism of hepatocyte LO2, and to explore the potential mechanism. METHODS: miR-19a was over-expressed or silenced by transfection of miR-19a mimics or miR-19a inhibitor into LO2 cells, then the mRNA level of miR-19a was detected by real-time PCR. The potential target of miR-19a was found by the method of bioinformatics through internet website. The effect of miR-19a on the 3’ UTR of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) was measured by dual luciferase reporter assay, and the protein level of PPARα and its 2 major downstream rate-limiting enzymes involved in lipid catabolism, acyl-coenzyme a dehydrogenase (ACADM) and carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A), were detected by Western blotting. Meanwhile, the effect of miR-19a on the generation of ketone body was measured by beta-hydroxybutyric acid (β-OHB) detection assay. RESULTS: The mRNA level of miR-19a was dramatically elevated by the transfection of miR-19a mimics, and sharply decreased by the transfection of miR-19a inhibitor (P<0.05). PPARα was found as a potential target of miR-19a, and dual luciferase reporter assay and Western blotting confirmed the regulatory effect of miR-19a on the expression of PPARα, with the protein level changes of ACADM and CPT1A. miR-19a mimics down-regulated, while miR-19a inhibitor up-regulated the concentration of β-OHB in LO2 cells (P<0.05). CONCLUSION: miR-19a regulates the lipid catabolism of hepatocytes by targeting the PPARα and its 2 downstream rate-limiting enzymes.

MicroRNA-19a; Peroxisome proliferator-activated receptor α; Lipid catabolism

1000- 4718(2015)03- 0481- 04

2014- 09- 28

2014- 12- 09

△通訊作者 Tel: 0715-8896219; E-mail: lin3126@126.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.017