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        類胰蛋白酶通過激活PAR-2促進腸黏膜上皮IEC-6細胞損傷*

        2015-04-17 07:53:46黃品婕甘小亮
        中國病理生理雜志 2015年3期
        關鍵詞:胰酶培養(yǎng)液小腸

        李 順, 黃品婕, 葛 緬, 甘小亮

        (1中山大學附屬第三醫(yī)院麻醉科,廣東 廣州 510630; 2中山大學中山眼科中心麻醉科,廣東 廣州 510060)

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        類胰蛋白酶通過激活PAR-2促進腸黏膜上皮IEC-6細胞損傷*

        李 順1, 黃品婕1, 葛 緬1, 甘小亮2△

        (1中山大學附屬第三醫(yī)院麻醉科,廣東 廣州 510630;2中山大學中山眼科中心麻醉科,廣東 廣州 510060)

        目的: 觀察類胰蛋白酶(tryptase)對小腸黏膜上皮細胞IEC-6的作用及機制。方法: 體外培養(yǎng)IEC-6細胞,隨機分為對照(control)組、tryptase處理組、蛋白酶激活受體 2(PAR-2)抑制劑(FSLLRY-NH2,F(xiàn)S)處理組以及tryptase+FS處理組。采用MTT法檢測細胞生存率;測定分泌的乳酸脫氫酶(LDH)活性;Western blotting 測定PAR-2和cleaved-caspase 3的表達。結(jié)果: 與對照組比,100 μg/L和1 000 μg/L 類胰蛋白酶導致細胞生存率明顯降低(P<0.05)。與對照組相比,10 μg/L到1 000 μg/L類胰蛋白酶導致LDH的活性明顯增加(P<0.05)。與對照組相比,100 μg/L和1 000 μg/L 類胰蛋白酶導致細胞的PAR-2及cleaved-caspase 3表達明顯升高(P<0.05)。與1 000 μg/L tryptase處理組比較,F(xiàn)S能夠明顯增加細胞生存率、降低LDH活性及cleaved-caspase 3表達(P<0.05)。 結(jié)論: 類胰蛋白酶通過激活PAR-2促進IEC-6細胞損傷,且這種損傷呈濃度依賴性。

        類胰蛋白酶; 蛋白酶激活受體2; IEC-6細胞; 乳酸脫氫酶; Caspase 3

        我們在既往研究中發(fā)現(xiàn)肥大細胞激活釋放炎性介質(zhì)加重了小腸缺血-再灌注損傷進程[1]。在眾多釋放的炎性介質(zhì)中,類胰蛋白酶約占1/4~1/2[2],具有廣泛的生物活性,如導致高血壓病心肌纖維化[3]和星形膠質(zhì)細胞活化[4]等。

        蛋白酶激活受體2(protease activated receptor-2, PAR-2)作為一種G蛋白偶聯(lián)膜受體,廣泛分布在胃腸道等臟器和組織中。同時,我們前期在動物模型中發(fā)現(xiàn)抑制類胰蛋白酶能夠減輕小腸黏膜損傷,且類胰蛋白酶的變化與PAR-2的變化趨勢一致[5]。前期研究結(jié)果提示類胰蛋白酶可能通過PAR-2途徑導致小腸黏膜損傷,為了證實上述設想,本研究擬在體外細胞實驗中,通過直接阻斷PAR-2來觀察類胰蛋白酶對大鼠小腸上皮細胞系IEC-6的作用。

        材 料 和 方 法

        1 細胞

        IEC-6細胞系購于北京協(xié)和細胞庫。IEC-6細胞用含4.5 g/L高糖DMEM培養(yǎng)液、體積分數(shù)5% FBS、10mg/L胰島素的混合培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24~50代的細胞用于本次實驗。

        2 材料與試劑

        DMEM-H、胎牛血清和0.25%胰酶(Gibco);類胰蛋白酶(Promega);PAR-2抑制劑FSLLRY-NH2(FS, Sigma);MTT試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒和DMSO溶劑(KeyGEN);PAR-2單克隆抗體(Santa Cruz);Total-caspase 3、 cleaved-caspase 3單克隆抗體(CST)。

        3 主要方法

        3.1 實驗分組 實驗分為對照(control)組、tryptase處理組、PAR-2抑制劑FS處理組以及tryptase+FS處理組。對照組用含1% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)。tryptase處理組分為4個終濃度組:1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L及1 000 μg/L;FS處理組給予FS使終濃度為400 μmol/L。實驗重復3~4次。

        3.2 MTT細胞增殖及細胞毒性檢測 IEC-6細胞用1 mL 0.25%胰酶消化后以每孔5 000個的密度接種于96孔板,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞密度增至90%(約2.5×104/well)時,再予以相應的藥物處理(培養(yǎng)液中含1% FBS),每孔培養(yǎng)液體積為100 μL。每組復設4孔,每孔加入1×MTT (0.5 g/L) 試劑,在37 ℃孵育4 h;吸出上清,每孔加入150 μL DMSO,用平板搖床搖勻10 min; 設置本底孔(完全培養(yǎng)基加MTT,無細胞),采用酶標儀490 nm波長測定各孔吸光度(A)值。細胞存活率=(A實驗孔-A本底孔)/(A對照孔-A本底孔)×100%。

        3.3 LDH活性檢測 IEC-6細胞用1 mL 0.25%胰酶消化后以每孔10 000個密度接種于96孔板,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞密度增至90%(約5×104/well),PBS洗板2次后再予以相應的藥物處理(培養(yǎng)液中含1% FBS);收集上清,在4 ℃、12 000 ×g的條件下離心15 min,每個樣本取50 μL用于后續(xù)檢測。依據(jù)LDH檢測試劑盒操作說明,設置標準管、標準空白管、測定管和對照管后逐步進行,最后于440 nm處測各檢測孔A值。

        LDH活性(U/L)=(測定管A值-對照管A值)/(標準管A值-空白管A值)×標準品濃度(2 mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)×1 000。

        3.4 Western blotting檢測PAR-2及cleaved-caspase 3的蛋白水平 IEC-6細胞使用胰酶消化后以每板4×105個的密度接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h,待細胞密度增至90%(約每板2×106個)后進行相應的藥物處理(處理組含1% FBS)。將培養(yǎng)板置于冰上,用冷PBS洗滌3遍,用全蛋白提取液刮取,超聲裂解后于12 000 ×g4 ℃ 離心15 min,取上清,進行BCA蛋白定量后變性、上樣,分別采用10%和15% SDS-PAGE分離蛋白(200 V,45 min)。轉(zhuǎn)膜使用PVDF膜(100 V,60 min)。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入抗PAR-2的I抗(1∶500)和cleaved-caspase 3 、caspase 3的I抗(1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗滌3次,加入相應的II抗(1∶2 000,CST)室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,曝光。膜用TBST洗滌后,改用抗β-actin的I抗按相同的方法繼續(xù)孵育,曝光。 所有Western blotting的 結(jié)果均用AlphaView 3.4.0.0進行灰度分析。

        4 統(tǒng)計學處理

        所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,應用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行分析,各組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        1 類胰蛋白酶對IEC-6細胞生長的作用

        Tryptase終濃度為1、10、100、1 000 μg/L時,IEC-6細胞的生存率分別為(98.0±7.8)%、(84.7±7.1)%、(56.5±14.9)%、(34.0±7.9)%。與對照組比,tryptase 100 μg/L組和1 000 μg/L組生存率均明顯降低(P<0.05),見圖1。

        2 類胰蛋白酶對IEC-6乳酸脫氫酶釋放量的影響

        10 μg/L tryptase組的LDH釋放量為(360±48)U/L,100 μg/L組為(588±60)U/L,1 000 μg/L組為(659±46)U/L,后2組與對照組相比,均有明顯升高(P<0.05),見圖2。

        Figure 2.LDH release from IEC-6 cells after treatment with tryptase for 12 h. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μg/L.

        3 類胰蛋白酶對IEC-6細胞PAR-2蛋白表達的影響

        與對照組相比,100 μg/L和1 000 μg/L tryptase濃度使得PAR-2的表達水平明顯上升(P<0.05),見圖3。

        Figure 3.The expression of PAR-2 in IEC-6 cells after treatment with tryptase for 12 h. Mean±SD. n= 3. *P<0.05 vs 0 μg/L.

        4 PAR-2抑制劑FS 對類胰蛋白酶致IEC-6損傷的作用

        1 000 μg/L tryptase 明顯增加LDH的釋放量、降低細胞生存率及顯著增加cleaved-caspase 3的表達(P<0.05)。與1 000 μg/L tryptase組比較,使用400 μmol/L FS能夠拮抗1 000 μg/L tryptase引起的上述指標改變(P<0.05);與對照組比較,F(xiàn)S本身對上述3項指標均無影響,見圖4、表1。

        Figure 4.The expression of cleaved-caspase 3 in IEC-6 cells after treatment with tryptase (1 000 μg/L) and/ or FS(400 μmol/L).Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs tryptase group.

        表1 各處理組細胞生存率、LDH釋放量與對照組的比較

        *P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstryptase group.

        討 論

        在小腸缺血-再灌注損傷期間,大量因素可導致肥大細胞激活并釋放大量生物活性物質(zhì),包括組胺,5-羥色胺、肝素、趨化因子、過氧化物酶、類胰蛋白酶、胃促胰酶和羧肽酶等[6]。其中類胰蛋白酶具有廣泛的生物學效應,不僅促進中性粒細胞聚集并釋放炎癥介質(zhì)[7],而且增加微血管通透性并促進新生血管形成[8]。Zhang 等[9]發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶促進的炎癥細胞聚集及細胞凋亡在腹主動脈瘤形成的病理生理過程中起到主導作用。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)隨著類胰蛋白酶濃度升高,體外培養(yǎng)的大鼠小腸黏膜上皮細胞IEC-6的生長率逐漸降低、LDH的釋放量逐漸增加、細胞凋亡增加,這些結(jié)果進一步證明,類胰蛋白酶具有對IEC-6細胞損傷作用,且具有濃度相關性,與既往研究報道類胰蛋白酶導致大腸黏膜細胞凋亡增加的結(jié)果一致[5]。

        肥大細胞廣泛分布于消化道黏膜下層結(jié)締組織中的毛細血管及淋巴管周圍,其類胰蛋白酶的釋放是炎癥性腸道疾病的主要發(fā)病因素[10]。在正常腸黏膜組織中,其類胰蛋白酶的濃度在8.0~154.6 μg/g之間,但在過敏性腸道疾病中,類胰蛋白酶濃度升高至525 μg/g左右[11],因此,本研究選擇類胰蛋白酶的量為1 μg/L~1 000 μg/L之間,遠低于文獻報道選用的12 mg/L[12],研究結(jié)果進一步證實類胰蛋白酶在腸黏膜損傷中的關鍵作用。

        目前已發(fā)現(xiàn)4種PAR受體(PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4),其中PAR-2能特異性被類胰蛋白酶和胰蛋白酶(trypsin)激活,而其它的PAR受體則被凝血酶(thrombin)激活。PAR-2分布廣泛,在胃腸道系統(tǒng)尤為豐富?,F(xiàn)已經(jīng)證明,PAR-2參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。Antoniak等[13]發(fā)現(xiàn),敲除PAR-2能減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷。McLarty 等[3]報道類胰蛋白酶/PAR-2信號通路是高血壓狀態(tài)下心肌纖維化的重要發(fā)病機制。也有人在體外證實,通過激活PAR-2受體可使HepG2細胞內(nèi)Ca2+濃度升高、cyclinD mRNA表達上調(diào),加速HepG2細胞周期進程,促進DNA合成,從而促進肝癌細胞的增殖[14]。王輝等[15]在研究炎性腸病大鼠模型中發(fā)現(xiàn),其迷走神經(jīng)背側(cè)運動核中存在PAR- 1和 PAR- 2,它們激活后通過磷脂酶C和三磷酸肌醇通路參與進行調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶抑制劑減輕小腸缺血-再灌注損傷并伴隨著PAR- 2表達的下調(diào)[5, 16]。這種伴隨現(xiàn)象使得我們有理由推測類胰蛋白酶/PAR-2 組成的信號通路可能在小腸缺血-再灌注損傷中起著關鍵作用。本體外細胞研究進一步發(fā)現(xiàn),類胰蛋白酶刺激IEC-6細胞12 h后,PAR-2的表達上調(diào),且與類胰蛋白酶濃度呈正相關。使用PAR-2的特異性抑制劑FSLLRY-NH2能逆轉(zhuǎn)tryptase對IEC-6細胞的損傷作用,值得提出的是,本研究發(fā)現(xiàn)PAR-2抑制劑FSLLRY-NH2本身對IEC-6細胞無明顯的生物學作用,與其在有類胰蛋白酶或者胰蛋白酶存在時,選擇性地競爭性抑制PAR-2受體有關[17]。以上結(jié)果進一步證實類胰蛋白酶通過激活PAR-2受體,導致IEC-6細胞損傷。

        [1] Huang P, Liu D, Gan X, et al. Mast cells activation contribute to small intestinal ischemia reperfusion induced acute lung injury in rats[J]. Injury, 2012, 43(8):1250-1256.

        [2] Pejler G, Abrink M, Ringvall M,et al. Mast cell proteases[J]. Adv Immunol, 2007, 95:167-255.

        [3] McLarty JL, Meléndez GC, Brower GL, et al. Tryptase/Protease-activated receptor 2 interactions induce selective mitogen-activated protein kinase signaling and collagen synthesis by cardiac fibroblasts[J]. Hypertension,2011, 58(2):264-270.

        [4] Zeng X, Zhang S, Xu L, et al. Activation of protease-activated receptor 2-mediated signaling by mast cell tryptase modulates cytokine production in primary cultured astrocytes[J]. Mediators Inflamm, 2013, 2013:140812.

        [5] Liu D, Gan X, Huang P, et al. Inhibiting tryptase after ischemia limits small intestinal ischemia-reperfusion injury through protease-activated receptor 2 in rats[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2012, 73(5):1138-1144.

        [6] Schwartz LB, Austen KF. Enzymes of the mast cell gra-nule[J]. J Invest Dermatol, 1980, 74(5):349-353.

        [7] Ribatti D, Nico B, Finato N, et al. Tryptase-positive mast cells and CD8-positive T cells in human endometrial can-cer[J]. Pathol Int, 2011, 61(7): 442-444.

        [8] Yamagishi H, Mochizuki Y, Hamakubo T, et al. Basophil-derived mouse mast cell protease 11 induces microvascular leakage and tissue edema in a mast cell-independent manner[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 415(4): 709-713.

        [9] Zhang J, Sun J, Lindholt JS, et al. Mast cell tryptase deficiency attenuates mouse abdominal aortic aneurysm formation[J]. Circ Res, 2011, 108(11): 1316-1327.

        [10]Hamilton MJ, Sinnamon MJ, Lyng GD, et al. Essential role for mast cell tryptase in acute experimental colitis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(1): 290-295.

        [11]Hagel AF, deRossi T, Zopf Y, et al. Mast cell tryptase levels in gut mucosa in patients with gastrointestinal symptoms caused by food allergy[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2013, 160(4):350-355.

        [12]Magarinos NJ, Bryant KJ, Fosang AJ, et al. Mast cell-restricted, tetramer-forming tryptases induce aggrecanolysis in articular cartilage by activating matrix metalloproteinase-3 and -13 zymogens[J]. J Immunol, 2013, 191(3):1404-1412.

        [13]Antoniak S, Rojas M, Spring D, et al. Protease-activated receptor 2 deficiency reduces cardiac ischemia/reperfusion injury[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(11):2136-2142.

        [14]鄭艷敏,謝立群,趙軍艷,等. PAR-2激動劑對肝癌細胞增殖及Ca2+水平的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(12): 2371-2375.

        [15]王 輝,黃美近,康 亮,等. 蛋白酶激活受體在炎性腸病大鼠模型迷走神經(jīng)背側(cè)運動核的表達及作用[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(5): 998-1003.

        [16]Gan X, Liu D, Huang P, et al. Mast-cell-releasing tryptase triggers acute lung injury induced by small intestinal ischemia-reperfusion by activating PAR‐2 in rats[J]. Inflammation, 2012, 35(3):1144-1153.

        [17]Al-Ani B, Saifeddine M, Wijesuriya SJ, et al. Modified proteinase-activated receptor-1 and -2 derived peptides inhibit proteinase-activated receptor-2 activation by trypsin[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2002, 300(2):702-708.

        Role of PAR-2 in tryptase mediated IEC-6 cell injury

        LI Shun1, HUANG Pin-jie1, GE Mian1, GAN Xiao-liang2

        (1DepartmentofAnesthesiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofAnesthesiology,ZhongshanOphthalmicCentre,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail:ganxiaoliang@yeah.net)

        AIM: To investigate the role of protease activated receptor-2 (PAR-2) in the process of tryptase mediated IEC-6 cell injury. METHODS: The rat intestinal epithelial cell line IEC-6 was treated with tryptase at different concentrations (1 μg/L, 10 μg/L, 100 μg/L and 1 000 μg/L) in the presence or absence of PAR-2 antagonist FSLLRY-NH2 for 12 h respectively. The cell survival rate was detected by MTT assay. The protein levels of PAR-2 and cleaved-caspase 3 were determined by Western blotting. The LDH activity was also measured. RESULTS: Compared with control group, the cell survival rates were significantly decreased in 100 μg/L and 1 000 μg/L tryptase treated groups, the LDH activities were significantly increased in 10 μg/L to 1 000 μg/L tryptase treated groups, and the protein levels of PAR-2 and cleaved caspase 3 were significantly increased in 100 μg/L and 1 000 μg/L tryptase treated groups (P<0.05). Compared with 1 000 μg/L tryptase treated group, the LDH activity and cleaved caspase 3 protein level were dramatically decreased while the survival rate was significantly increased in the presence of PAR-2 antagonist FSLLRY-NH2 (P<0.05). CONCLUSION: Tryptase induces IEC-6 cell injury in a dose-dependent manner by activating PAR-2.

        Tryptase; Protease activated receptor-2; IEC-6 cells; Lactate dehydrogenase; Caspase 3

        1000- 4718(2015)03- 0530- 04

        2014- 08- 28

        2014- 09- 28

        廣州市科技計劃(No. 2014J4100172);中山大學青年教師培育項目(No. 12ykpy37)

        △通訊作者 Tel: 020-87331548; E-mail: ganxiaoliang@yeah.net

        R363.2

        A

        10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.025

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