平 勇， 邸平山， 李衛(wèi)兵， 李鳳梅， 陳為一， 陳萍萍

(東港區(qū)人民醫(yī)院 1骨科， 2急診科，山東 日照 276800；3五蓮縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東 日照 262300； 4濰坊醫(yī)學(xué)院病理教研室，山東 濰坊 261053)

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Gab2在人骨肉瘤細胞U2-OS中的表達及意義

平 勇1△， 邸平山3， 李衛(wèi)兵1， 李鳳梅2， 陳為一4， 陳萍萍4

(東港區(qū)人民醫(yī)院1骨科， 2急診科，山東 日照 276800；3五蓮縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東 日照 262300； 4濰坊醫(yī)學(xué)院病理教研室，山東 濰坊 261053)

目的： 探討Grb2協(xié)同結(jié)合蛋白2(Gab2)在人骨肉瘤細胞系中的表達及其與人骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法: 應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)，將合成的小RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染給人骨肉瘤U2-OS細胞，采用Western blotting和RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后Gab2的蛋白和mRNA表達水平；體外細胞趨化運動實驗和侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果: Gab2在人骨肉瘤U2-OS細胞系中高表達，且轉(zhuǎn)染Gab2 siRNA后的細胞(SiGab2/U2-OS)中Gab2蛋白及mRNA的表達水平低于轉(zhuǎn)染scramble siRNA細胞(Scr/U2-OS)和U2-OS；趨化運動實驗發(fā)現(xiàn)在10 μg/L表皮生長因子 (EGF)的誘導(dǎo)下SiGab2/U2-OS細胞的遷移能力較U2-OS和Scr/U2-OS細胞明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；SiGab2/U2-OS細胞侵襲并穿透Matrigel 膜基質(zhì)的細胞數(shù)量均比Scr/U2-OS細胞和U2-OS 細胞少，SiGab2/U2-OS細胞的體外侵襲能力顯著降低(P<0.01)。結(jié)論: 利用siRNA干擾技術(shù)降低Gab2的表達對人骨肉瘤U2-OS細胞的遷移和侵襲能力有明顯的抑制作用。

Grb2協(xié)同結(jié)合蛋白 2； 小干擾RNA； 細胞侵襲； U2-OS細胞

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一種最常見的惡性骨腫瘤，占原發(fā)惡性骨腫瘤的20%，血行轉(zhuǎn)移早且發(fā)生率高，骨肉瘤轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因，是嚴重影響青壯年身心健康的疾病[1-3]。生長因子受體結(jié)合蛋白 2(growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種細胞內(nèi)分子[4]，系相關(guān)結(jié)合蛋白家族的成員之一[5]而Grb2協(xié)同結(jié)合蛋白2(Grb2-associated binding protein-2，Gab2)是一個重要的腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控蛋白，在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[6]。有研究證明Gab2具有潛在的原癌基因特性，在肺癌和膠質(zhì)瘤中呈高表達[7-8]，但尚不清楚Gab2是否參與骨肉瘤的遷移和侵襲。本研究采用小RNA干擾技術(shù)抑制人骨肉瘤U2-OS 細胞中的Gab2的表達，實驗觀察Gab2對骨肉瘤U2-OS細胞體外遷移和侵襲能力的影響，從而為控制骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和臨床治療提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

鼠抗人Gab2抗體、羊抗鼠IgG均為Santa Cruz產(chǎn)品；fibronectin購自Sigma； DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone；胰蛋白酶、D0018 質(zhì)粒中量抽提試劑盒、彩色預(yù)染蛋白均購自碧云天；胎牛血清購自杭州四季青公司；遷移和侵襲實驗所用24孔細胞培養(yǎng)板購自Corning；Matrigel膜基質(zhì)購自北京威格拉斯公司；24孔Transwell板、細胞轉(zhuǎn)染試劑購自康為世紀(jì)。Gab2的目標(biāo)片段5'-GTGAGAACGATGAGAAATA-3' 的小RNA干擾質(zhì)粒和scramble(Scr)序列的小RNA干擾質(zhì)粒均由上海吉瑪公司構(gòu)建；人骨肉瘤U2-OS細胞株由濰坊醫(yī)學(xué)院科研中心實驗室提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人骨肉瘤U2-OS細胞株培養(yǎng)于DMEM/F10培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的U2-OS細胞做實驗，細胞分3組：(1)U2-OS細胞：常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；(2)Scr/U2-OS細胞：瞬時轉(zhuǎn)染插入具有一段scramble序列的質(zhì)粒作對照；(3)SiGab2/U2-OS細胞:瞬時轉(zhuǎn)染插入干擾Gab2具有目標(biāo)片段5’-GTGAGAACGATGAGAAATA-3’的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。

2.2 RT-PCR實驗 取對數(shù)生長期的各組細胞，利用Trizol提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用RT-PCR試劑盒測定細胞中的Gab2的 mRNA水平，以β-actin作為內(nèi)參照。具體操作步驟和引物參照文獻[9]進行。取5 μL 的PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察拍照。

2.3 Western blotting實驗 將轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)72 h后，提取蛋白。行SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，滴加Gab2的I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，結(jié)合 II 抗孵育后曝光顯影。

2.4 趨化運動實驗 將細胞重懸，終濃度為0.5×109cells/L。在小室下層板中加入含0、1、10、100和1 000 μg/L 表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的培養(yǎng)液，在上層板和下層板之間加入1張預(yù)先用0.001% fibronectin、4 ℃包被過夜的8 μm的濾膜。將細胞懸液加入上層板中，每孔50 μL。然后將趨化小室放入孵育箱，37 ℃、5% CO2，經(jīng)孵育3 h后，將濾膜上層細胞刮去，洗滌并染色，在400倍顯微鏡視野下觀察計數(shù)。每孔隨機取3個視野，其和作為該孔細胞數(shù)。

2.5 體外侵襲能力的檢測 按文獻[7]操作，在小室下層加入10 μg/L EGF刺激，結(jié)果置400倍顯微鏡下觀察5個高倍鏡視野，計數(shù)Transwell小室下室面的細胞數(shù)即為穿透人工基膜的細胞數(shù)，每個實驗重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實驗結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，符合方差齊性的用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用SPSS 16.0軟件做實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理。

結(jié) 果

1 Western blotting實驗檢測Gab2蛋白的含量

對瞬時轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，提取蛋白，經(jīng)Western blotting實驗檢測Gab2蛋白的含量?；叶葤呙瓒匡@示，U2-OS細胞、Scr/U2-OS細胞和SiGab2/U2-OS細胞中均可見Gab2蛋白表達，與β-actin的灰度比分別為1.00、0.98和0.36，但SiGab2/ U2-OS組中Gab2蛋白的條帶亮度明顯降低，差異較大，說明小RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

Figure 1.Determination of Gab2 protein expression by Western blotting in U2-OS cells, Scr/U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells.

2 RT-PCR實驗檢測Gab2 mRNA的表達

應(yīng)用凝膠圖像分析儀對Gab2和β-actin的條帶作灰度分析，并對Gab2的 mRNA表達強度做出半定量分析，結(jié)果顯示SiGab2/U2-OS細胞中Gab2 的mRNA條帶亮度明顯低于Scr/U2-OS細胞和 U2-OS細胞，差異較大，該結(jié)果進一步證明了小RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，Gab2基因表達被抑制，建立Gab2低表達的實驗細胞組，為后續(xù)實驗提供了條件，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of Gab2 was detected by RT-PCR in U2-OS cells，Scr/ U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells.

3 趨化運動實驗

經(jīng)EGF的誘導(dǎo)后，通過觀察細胞計數(shù)并繪圖發(fā)現(xiàn)，U2-OS細胞和Scr/ U2-OS細胞具有很強的趨化運動能力，且呈現(xiàn)“鐘形”曲線，10 μg/L的EGF為最佳趨化濃度。U2-OS和Scr/ U2-OS細胞的趨化指數(shù)分別是7.74±0.30和7.78±0.33，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SiGab2/ U2-OS細胞的趨化運動能力明顯降低，趨化指數(shù)為3.31±0.29，與U2-OS和Scr/ U2-OS細胞相比差異顯著(P<0.01)。提示降低U2-OS細胞中Gab2蛋白的表達確實抑制了細胞定向遷移的能力，見圖3。

Figure 3.The effects of Gab2 expression on the chemotactic ability of U2-OS cells，Scr/ U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs U2-OS.

4 體外侵襲實驗

細胞體外侵襲實驗顯示，U2-OS細胞、Scr/U2-OS細胞和SiGab2/ U2-OS細胞的穿透細胞數(shù)分別為47±8、48±10和26±2；與U2-OS細胞、Scr/ U2-OS細胞相比轉(zhuǎn)染小RNA干擾質(zhì)粒成功后SiGab2/U2-OS細胞組穿過8 μm微孔濾膜細胞數(shù)目明顯減少，差異顯著(P<0.01)；2個對照組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

討 論

骨肉瘤是常見的惡性骨腫瘤之一，多發(fā)生于青壯年，該腫瘤惡性程度高，侵襲能力強，通過血道出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移早。Gab2是1個由1 870個氨基酸殘基構(gòu)成的大分子蛋白質(zhì), 又被命名為Akt磷酸化增強子(Akt phosphorylation enhancer，APE)[10]，是支架蛋白Gab家族的重要成員，在人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色[6]，Gab2的缺失可以降低小鼠髓系的異常增生現(xiàn)象[11]。有研究表明在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中Gab2作為重要的潛在驅(qū)動因子起著不可或缺的作用[12]。骨肉瘤細胞的趨化運動是腫瘤生長和侵襲的關(guān)鍵一步，在骨肉瘤細胞侵襲中發(fā)揮重要作用，且貫穿于骨肉瘤細胞侵襲的全過程。

Figure 4.The invasion abilities of U2-OS cells, Scr/U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells. A: the microscopic images of the invading cells (×400); B:the number of invading cells in five high power fields.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs U2-OS.

本文將帶有Gab2目標(biāo)片段的小RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人骨肉瘤U2-OS細胞株，建立了Gab2瞬時表達的SiGab2/U2-OS細胞，并用Western blotting 法檢測證實了Gab2蛋白在人骨肉瘤U2-OS細胞中有高表達，其在SiGab2/U2-OS細胞中的表達則明顯降低。我們同時做了細胞體外趨化實驗和體外侵襲實驗，以觀察Gab2蛋白表達降低對骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示SiGab2/U2-OS 細胞的遷移和侵襲能力明顯降低，且與Scr/U2-OS細胞和U2-OS細胞相比差異顯著。這一結(jié)果證實降低Gab2的表達確能抑制人骨肉瘤U2-OS細胞的遷移和侵襲能力，明確提示 Gab2參與了調(diào)控骨肉瘤的遷移和侵襲的過程，進而可能在骨肉瘤的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。而關(guān)于Gab2在調(diào)控骨肉瘤細胞遷移和侵襲的分子機制，有待進一步研究。

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Expression of Gab2 in human osteosarcoma U2-OS cells

PING Yong1, DI Ping-shan3, LI Wei-bing1, LI Feng-mei2, CHEN Wei-yi4, CHEN Ping-ping4

(1DepartmentofOrthopaedics;2EmergencyDepartment,ThePeople’sHospitalofDonggangRegion,Rizhao276800,China;3DepartmentofCardiology,ThePeople’sHospitalofWulianRegion,Rizhao262300,China;4DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail:ppyy2000@163.com)

AIM: To investigate the expression of Grb2-associated binding protein 2 (Gab2) in human osteosarcoma cells and its relationship with the invasion and metastases of human osteosarcoma cells. METHODS: The technique of small RNA interference was used to transfect human osteosarcoma U2-OS cell lines. Western blotting and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of Gab2 in transfected U2-OS cells. After transfection, through chemotaxis and invasion assaysinvitro, the cell migration and invasion abilities were detected. RESULTS: After transfection, the expression of Gab2 at mRNA and protein levels in Gab2 siRNA transfected cells (SiGab2/U2-OS) was lower than that in scrambled siRNA transfected cells (Scr/U2-OS) and U2-OS cells. After stimulation with epidermal growth factor (EGF) at concentration of 10 μg/L, the migration SiGab2/U2-OS cells was significantly less than Scr/U2-OS cells and U2-OS cells (P<0.01). The number of invasion cells of SiGab2/U2-OS group was significantly lower than the other 2 control groups (P<0.01). CONCLUSION: Inhibition of Gab2 expression obviously attenuates the migration and invasion abilities of human osteosarcoma U2-OS cell line.

Grb2-associated binding protein 2; Small interference RNA; Cell invasion; U2-OS cells

1000- 4718(2015)03- 0568- 04

2014- 06- 18

2014- 12- 31

△通訊作者 Tel： 0633-8022967； E-mail： ppyy2000@163.com

R730.23

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.033