張 巍， 金 瑛， 朱文赫， 李 妍， 羅 軍， 蘆曉靜， 陳默然， 姜艷霞

(吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132013)

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肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶抑制劑胡桃醌對宮頸鱗癌SiHa細胞凋亡的作用*

張 巍△， 金 瑛， 朱文赫， 李 妍， 羅 軍， 蘆曉靜， 陳默然， 姜艷霞

(吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132013)

目的： 探討肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶抑制劑胡桃醌對宮頸鱗癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響及其促凋亡的機制。方法: 選取處于對數(shù)生長期的SiHa細胞，將其分為空白對照組和不同劑量(10、20、50、80及100 μmol/L)胡桃醌給藥組，共6組。采用MTT法觀察胡桃醌對SiHa細胞的抑制作用，并計算出半數(shù)抑制濃度(IC50=20.4 μmol/L)，依據(jù)IC50確定胡桃醌的有效濃度；選取與IC50接近的濃度(20 μmol/L)通過Hoechst 33258及流式細胞術(shù)測定胡桃醌對SiHa細胞凋亡的影響，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、8、9以及抑癌基因PTEN的蛋白水平。結(jié)果: MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，各給藥組對細胞活力的抑制作用明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Hoechst 33258檢測表明，20 μmol/L胡桃醌處理細胞12 h后可出現(xiàn)明顯的細胞核典型凋亡細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果說明胡桃醌可誘導SiHa細胞出現(xiàn)早期凋亡；Western blot檢測顯示與正常對照組相比，20 μmol/L胡桃醌處理細胞12 h后，cleaved caspase-3、8、9及PTEN的蛋白水平明顯增加。結(jié)論: 胡桃醌可以抑制SiHa細胞的活力，并誘導細胞凋亡，其機制主要是通過抑制caspase途徑并增加抑癌基因的表達。

胡桃醌； 肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶； 細胞凋亡； SiHa細胞

肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolylcis/transisomerase，Pin1)是癌細胞中普遍存在的高表達的基因之一，其在腫瘤細胞中與細胞的分化和增殖有關(guān)，在腫瘤細胞中過表達，在正常組織中則低表達，去除它則腫瘤細胞增殖減低，凋亡增加。胡桃醌(juglone)是從胡桃揪新鮮根、枝皮及青果皮等中提取出來的羥基奈醌類化合物，黃色針狀結(jié)晶，熔點為155 ℃, 有升華性，微溶于熱水,是核桃楸中毒性物質(zhì)之一[1]。Hennig等[2]的研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可以抑制Pin1的活性，Pin1可特異性催化蛋白分子中磷酸化的Ser/Thr-Pro基序發(fā)生順反異構(gòu)轉(zhuǎn)變。近來的研究報道顯示，胡桃醌對多種癌細胞株具有活性作用，包括S180實體瘤、小鼠腹水型肝癌和自發(fā)性胃癌等[2-3]。Bhargava等[3]和Varga等[4]研究還發(fā)現(xiàn)：胡桃醌對人外周血的淋巴細胞鉀離子通道具有封閉作用，影響了細胞的生長和T細胞增殖；胡桃醌還可直接修飾巰基基團，使RNA轉(zhuǎn)錄起始前復合物斷裂，導致細胞mRNA的合成抑制，發(fā)揮阻斷轉(zhuǎn)錄的作用[4-5]。除此之外，胡桃醌還具有誘導細胞凋亡的重要作用。另外的一些實驗發(fā)現(xiàn)，醌類化合物對細胞生長的抑制作用表現(xiàn)在S期的抑制，而且這種細胞毒性作用于醌類物質(zhì)的酚羥基個數(shù)相關(guān)[6]。而我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，胡桃醌可抑制宮頸癌HeLa細胞(含HPV18 DNA)的增殖及促其發(fā)生凋亡的作用[7]。本實驗旨在研究胡桃醌對另外一種宮頸鱗癌SiHa(含HPV16 DNA)的細胞凋亡的影響，從而為胡桃醌的抗宮頸癌作用提供重要的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑和儀器

SiHa細胞系由本院科研實驗室保存。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胡桃醌(5-羥基-1,4-奈醌)、Hoechst 33258和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 購于Sigma。I 抗兔抗人cleaved caspase-3，8，9和PTEN單克隆抗體均購自Abcam。Olympus 倒置顯微鏡(Olympus)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液并置于5% CO2、95%濕度及37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)過程中，2 d更換1次培養(yǎng)液，每周按1∶3傳代。

2.2 細胞活力的檢測 將培養(yǎng)的SiHa細胞按1×108/L的密度接種于96孔板，分為空白對照組及實驗組(10、20、50、80及100 μmol/L濃度的胡桃醌)共6組，再培養(yǎng)24 h 后,與空白對照組一起每孔加入20 μL MTT(5 g/L)， 37 ℃繼續(xù)孵育4 h。4 h后取出棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，測量前振板10 min，于570 nm測定A值。IC50通過計算軟件獲得。

2.3 細胞凋亡率檢測 取IC50附近濃度值20 μmol/L，采用Hoechst 33258染色法，細胞培養(yǎng)12 h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS 沖洗2 次，每次2 min; 加入多聚甲醛固定15 min，吸出固定液，用PBS 洗2 次，每次2～3 min; 每孔加入1 mL Hoechst 33258 工作液，避光染色5 min，熒光顯微鏡下檢測細胞凋亡，隨機觀察5個視野。

2.4 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔培養(yǎng)板過夜，棄上清，加入20 μmol/L胡桃醌，同時設(shè)正常對照組。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，PBS 洗滌細胞1 次，按試劑盒說明書分別加入Annexin V-FITC和PI，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。Annexin V及PI均陽性的細胞為凋亡細胞。

2.5 蛋白印跡法檢測蛋白表達 按2.4方法處理細胞，加藥12 h 后提取細胞蛋白，BCA 法測蛋白濃度，變性后上樣30 μg，于12% SDS-PAGE 分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜并用5%脫脂奶粉于37 ℃條件下封閉2 h，抗 cleaved caspase-3、8、9和PTEN的 I 抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，HRP標記的 II 抗室溫孵育2 h，曝光顯影。實驗組的表達水平與對照組相比為相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 胡桃醌對SiHa細胞生長的影響

MTT實驗表明胡桃醌對SiHa細胞生長的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，隨胡桃醌濃度的增加抑制作用增強；各給藥組與對照組比較，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IC50為20.4 μmol/L，見圖1。

Figure 1.The effect of different concentrations of juglone on the cell viability. Mean±SD. n=4. *P<0.05， **P<0.01 vs 0 μmol/L.

2 胡桃醌對SiHa細胞核形態(tài)的影響

對照組SiHa細胞大小均一，成彌散均勻的淡藍色弱熒光；經(jīng)20 μmol/L胡桃醌處理12 h后，SiHa細胞核明顯皺縮，并可見致密強熒光，存在核碎裂和凋亡小體等強熒光團塊，見圖2。

3 胡桃醌對SiHa細胞早期凋亡的影響

如圖3所示，胡桃醌(20 μmol/L)與SiHa細胞作用12 h后，細胞早期凋亡率(右下象限)明顯高于正常對照組(P<0.05)。

4 Western blotting 法確定胡桃醌對SiHa細胞內(nèi)caspase-3、8、9和PTEN蛋白含量的影響

如圖4所示，Western blotting 法分析表明20 μmol/L胡桃醌組cleaved caspase-3、8、9和PTEN蛋白表達均升高。

Figure 2.The nuclear morphological changes of the SiHa cells treated with 20 μmol/L juglone(×400).

Figure 3.The effect of juglone (20 μmol/L) on the early apoptosis of SiHa cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

Figure 4.The protein levels of caspase-3, 8, 9 and PTEN in the SiHa cells treated with juglone at concentration of 20 μmol/L for 12 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

討 論

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是它的主要致病原因, 在對宮頸癌高危人群的篩查及治療效果評價時，HPV是主要生物學指標[8-10]。在對HPV的治療上，目前尚無理想藥物，在高危HPV16、18等感染問題上，尤其缺乏針對性的特效方法。我國物產(chǎn)豐富，植物藥用資源很多, 在中草藥研究中，發(fā)現(xiàn)了一批療效好、不良反應(yīng)小的天然抗癌、抗病毒藥物，這為病毒感染所致癌癥的防治工作帶來了新的希望[11]。

胡桃醌又名5-羥基-1，4-萘醌，是一種從胡桃楸的葉、皮及外果殼中提取天然環(huán)狀醌類，早有抗腫瘤作用的報道。Pin1在各類癌細胞中普遍高表達，與癌細胞的分化與增殖有關(guān)，在正常組織中表達卻很低，敲除Pin1則腫瘤細胞增殖減低，細胞凋亡增加[12]。胡桃醌抗腫瘤活性的機制是胡桃醌與Pin1催化域不可逆性結(jié)合，抑制Pin1的活性，抑制了細胞的增殖，促進細胞的凋亡[13-14]。

本實驗以HPV16陽性的人宮頸鱗癌細胞株SiHa為研究對象, 研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的胡桃醌可明顯抑制SiHa細胞生長，其IC50為20.4 μmol/L。

細胞凋亡是指基因控制細胞自主的有序的死亡，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，這與細胞壞死過程明顯不同，細胞凋亡是一個主動過程，涉及一系列基因的激活與表達，在受控中發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用；而細胞壞死是病理條件下自體損傷現(xiàn)象，是一個被動的過程，細胞凋亡是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境，主動的一種死亡過程[15]。Caspase是一個在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用的酶家族，caspase-3可以剪切caspase-2、6、7、9的前體，這種蛋白酶剪切是細胞凋亡的重要組成部分。Caspase-8通常以酶原形式存在，在細胞凋亡過程中被激活，其被認為是caspase凋亡通路上游的酶，被激活后可激活下游的caspase-4、6、9和10。Caspase-9也屬于上游酶，被激活后可活化最關(guān)鍵的酶caspase-3，從而促進后續(xù)的細胞凋亡過程。本研究結(jié)果通過細胞核染色檢測觀察，發(fā)現(xiàn)胡桃醌可誘導癌細胞凋亡，進一步對其機制研究也發(fā)現(xiàn)，胡桃醌可導致cleaved caspase-3、8、9表達升高。PTEN為一種抑癌基因，通過化學通路傳導，把信號傳給細胞，使細胞停止分裂并進入程序性死亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可促進SiHa細胞的PETN蛋白表達。說明胡桃醌的促凋亡機制可能是通過激活caspase途徑以及提高抑癌基因的表達來實現(xiàn)的。

本研究旨在為宮頸癌的治療提供一個新的思路，其具體的作用機制及藥物作用的靶點等仍待進一步深入細致的研究。

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Pin1 inhibitor juglone induces apoptosis in human cervical cancer SiHa cells

ZHANG Wei, JIN Ying, ZHU Wen-he, LI Yan, LUO Jun, LU Xiao-jing, CHEN Mo-ran, JIANG Yan-xia

(JilinMedicalCollege,Jilin132013,China.E-mail:jlmmczw@163.com)

AIM: To explore the effect of peptidyl-prolylcis/transisomerase (Pin1) inhibitor juglone on apoptosis of human cervical cancer SiHa cells. METHODS: Cultured SiHa cells were incubated with juglone at concentrations of 10, 20, 50, 80 and 100 μmol/L for 24 h. The SiHa cell activity was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Hoechst 33258 staining. The protein levels of cleaved caspase-3,8,9 and PTEN was determined by Western blotting. RESULTS: In different doses of juglone groups, the SiHa cell growth was greatly inhibited (P<0.05) in a dose-dependent manner as compared with control group. The IC50of juglone was 20.4 μmol/L. After treatment with juglone at concentration of 20 μmol/L for 12 h, the apoptosis of SiHa cells was induced, and the typical morphological changes of cell apoptosis such as karyopyknotic pyknic hyperfluorescence bolus, nuclear fragmentation and apoptotic body were observed by Hoechst 33258 staining. The early apoptotic rate was increased significantly as compared with the control. The protein levels of cleaved caspase-3, 8, 9 and PTEN were also increased significantly as compared with control group. CONCLUSION: Juglone significantly inhibits the cell activity and induces the apoptosis of SiHa cellsinvitroby inhibiting the caspase pathway and increasing the expression of anti-oncogene.

Juglone; Peptidyl-prolylcis/transisomerase; Apoptosis; SiHa cells

1000- 4718(2015)03- 0543- 04

2014- 09- 23

2014- 12- 29

國家自然科學基金資助項目(No. 21102055)；吉林省科技廳科技發(fā)展項目(No. 20130101157JC)；吉林省教育廳“十二五”教育技術(shù)研究項目(No. 2012-314；2014-371)

△ 通訊作者 Tel: 0432-64560459; E-mail： jlmmczw@163.com

R363;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.028