王 航，蔡克銀，黃 浩

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房二科，湖北 武漢 430070；2.深圳市合一康生物科技有限公司臨床醫(yī)學中心，廣東 深圳 513000)

·論 著·

小鼠S1PR3慢病毒表達載體的構建及表達

王 航1，蔡克銀1，黃 浩2

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房二科，湖北 武漢 430070；2.深圳市合一康生物科技有限公司臨床醫(yī)學中心，廣東 深圳 513000)

目的 構建小鼠1-磷酸鞘氨醇受體3(S1PR3)慢病毒表達載體，并檢測其表達情況。方法小鼠心肌組織mRNA并逆轉錄得到cDNA，設計并合成引物，采用亞克隆方式將目的基因克隆至慢病毒表達載體pLent-IRES-EGFP中，將表達載體與包裝質粒共轉293T細胞，進行目的基因的過表達慢病毒包裝，隨后收集培養(yǎng)成功病毒，使用病毒感染小鼠L929細胞，檢測感染后L929細胞表達S1PR3情況。結果從小鼠心機組織cDNA中擴增出大小約1 100 bp的目的片段；雙酶切后成功將S1PR3克隆到慢病毒表達載體pLent-IRES-EGFP，表達質粒與包裝質粒供轉染293細胞后48 h就可以看到細胞中成功表達綠色熒光。收集培養(yǎng)成功病毒感染小鼠L929細胞，成功表達出S1PR3。結論本研究成功構建了可以高表達S1PR3的pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP慢病毒表達載體，為進一步調控S1PR3相關的細胞功能奠定了基礎。

慢病毒；1-磷酸鞘氨醇受體3；血管損傷；再內皮化

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P)是鞘磷脂代謝過程中產生的一種重要的信號分子，S1P受體共有5型，而3型受體S1PR3，因為在血管內皮損傷后修復的過程中有重要作用引起關注。研究表明，S1PR3可以募集中性粒細胞、巨噬細胞而共同參與動脈粥樣硬化斑塊的形成[1]。我們應用第三代慢病毒(Lentivirus)載體表達系統(tǒng)，成功構建了高表達小鼠S1PR3的重組慢病毒，用于探索某些信號通路在血管內皮損傷后的修復過程中的相關機理，為臨床防治AS提供可行的參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Opti-MEM培養(yǎng)基和Trizol試劑購自Invitrogen公司；限制性內切酶、T4連接酶均購自德國Sigma公司；小量質粒純化試劑盒購自日本TaKaRa公司；質粒中量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自德國Qiagen公司；293FT細胞株購自Invitrogen公司；DEPC、AMV反轉錄酶、dNTPs、Rnasin、TaqDNA聚合酶和DL2000 Marker為TaKaRa公司產品；哺乳類動物細胞轉染試劑盒POLO delivererTM3000購自銳賽(上海)生物技術有限責任公司。

1.2 引物設計與合成 依據(jù)Genbank所公布小鼠基因的序列，我們設計了S1PR3上、下游引物，同時分別將酶切位點BamHⅠ及NheⅠ添加到目的片段的上、下游。引物由銳賽(上海)生物技術有限責任公司合成。

1.3 慢病毒表達載體pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP構建 正常小鼠心肌組織分離，提取mRNA并逆轉錄得到cDNA模板，PCR擴增目的片段。具體PCR體系如下：模板1 μl，引物各2 μl，MgSO4(50 mmol/L)1 μl，dNTP(10 mmol/L)1 μl，10×Buffer，5.0 μl，plentinum pfx polymerase(5 U/μl)0.2 μl，總體積50 μl。PCR擴增程序：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸60 s，共45個循環(huán)，隨后68℃5 min。待PCR結束，瓊脂糖凝膠電泳，并回收約1 100 bp的片段，使用NheⅠ、BamHⅠ對所回收PCR的片段與目的載體分別進行酶切，具體酶切體系如下：10×Buffer 3 μl，PCR產物/目的質粒1 μg，限制性內切酶NheⅠ、BamHⅠ各0.5 μl，總體積30 μl，37℃酶切5 h，瓊脂糖電泳分離酶切產物，凝膠回收試劑盒回收目的片段。目的基因與載體基因的連接：連接體系如下：10×T4連接酶緩沖液1 μl，T4連接酶1 μl，目的條帶、載體酶切產物均各2 μl，總體積共為10 μl。連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，氨芐(Amp)陽性的LB平皿涂板，30oC培養(yǎng)10～12 h。挑選取單菌落，進行菌落的PCR鑒定。具體PCR擴增體系、循環(huán)程序如下：10×Buffer 1.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，dNTPs (10 mmol/L)0.5 μl，引物(10 mmol/L)各0.5 μl，Taq(5 U/μl)0.1 μl，總體積15 μl。循環(huán)條件如下：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共45個循環(huán)，隨后72℃延伸5 min。將已鑒定為陽性的克隆接種至LB液體培養(yǎng)基，搖菌10～12 h，并于第二天提取質粒，隨后DNA測序以進行鑒定。

1.4 重組病毒的包裝、擴增 抽提質粒的濃度在1 μg/μl左右，DNA的A260/A280在1.8～2.0之間。參照POLOdeliverer?3000 Transfection Reagent轉染流程，選擇生長狀態(tài)良好的293細胞包裝病毒，將包裝質粒、慢病毒表達載體pLenti-S1PR3-IRES-EGFP共轉染293T細胞。轉染之后48 h，第一次收集293T細胞培養(yǎng)的上清液；細胞換液后，繼續(xù)培養(yǎng)72～80 h，第二次收集培養(yǎng)的上清液，并與第一次所收集的病毒上清液相互混合。3 000 r/min離心10 min，除去細胞碎片。經(jīng)醋酸纖維素膜(0.45 μm)濾器將混合的上清液過濾至Beckman SW28離心管，收集濾液，每管分裝36 ml病毒。4°C 22 000 r/min離心2 h之后，小心取出離心管，吸棄上清液，然后于每管中分別加入預冷的DMEM 130 μl。待沉淀溶解完全后，收集病毒溶液，統(tǒng)一按照100 μl/管，分裝至1.5 ml EP管中。-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 慢病毒滴度測定 采用熒光顯微鏡直接觀測。將慢病毒濃縮液倍比稀釋，準備生長狀態(tài)良好的293細胞，每孔內均添加無抗生素、含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液400 μl。隨后，各孔再均添加終濃度為8 μg/ml(control細胞組除外)的Polybrene。將病毒原液倍比稀釋，各感染孔內添加100 μl，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，吸棄上清、更換培養(yǎng)基，加入10%FBS+1%P/S+1%Glutamax +500 μl DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。熒光顯微鏡下觀察感染72 h后各組細胞熒光表達情況，通過計算各組GFP陽性的細胞數(shù)，推算所制備的慢病毒滴度。

1.6 S1PR3表達檢測 選取培養(yǎng)的生長狀態(tài)良好的小鼠L929細胞，待融合度達到50%后加入病毒原液及Polybrene促進感染(終濃度為8μg/ml)。熒光顯微鏡下動態(tài)觀察GFP的表達情況，并拍照、記錄。感染48 h后，棄上清，Trizol裂解細胞，提取RNA。DNaseI處理后，反轉錄為cDNA，采用SYBR Green法熒光定量PCR檢測目的基因的表達情況?！鳌鰿t法計算各目的基因的相對表達定量，引物信息見表1。

表1 引物信息

2 結果

2.1 目的片段的PCR擴增 使用引物BamHⅠ-F和NheⅠ-Ry從小鼠心肌組織cDNA模板中擴增出S1PR3目的片段，并在目的片段上下游分別添加了BamHⅠ和Nhe1酶切位點，大小約1 100 bp，見圖1。

2.2 重組克隆的菌落PCR鑒定 挑取轉化產物單菌落，進行菌落PCR鑒定重組質粒。清晰可見大小約1 100 bp目的條帶，見圖2。

2.3 病毒包裝 選擇培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的293T細胞，轉染后動態(tài)觀察，轉染48 h的293T細胞中有明顯綠色熒光表達，見圖3和圖4。

圖1 目的片段的PCR擴增法

圖2 pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP重組載體菌落PCR鑒定

圖3 轉染后48 h，白光(×100)

圖4 轉染后48 h，熒光(×100)

2.4 目的基因表達檢測 使用培養(yǎng)好的病毒感染L929細胞，隨后使用Real time PCR法檢測感染后細胞的目的基因表達情況。可見重組病毒轉染細胞組中，目的條帶呈高表達；而空白載體轉染細胞組中未見目的基因S1PR3的表達，見圖5和圖6。

圖5 S1PR3和內參的溶解曲線

圖6 S1PR3目的基因表達情況

3 討論

S1P的特異性受體主要可分為5類(S1PR1-5)，它們均屬于G蛋白耦聯(lián)受體。心血管系統(tǒng)的多種細胞如內皮細胞、vSMCs、巨噬細胞等均可不同程度表達S1PR1、S1PR2或S1PR3，S1PR1耦聯(lián)Gi，作用相對較單一；S1PR2、S1PR3則可與Gi、Gq、G12/13等蛋白耦聯(lián)，參與不同細胞內各種信號通路的調控，具有多種重要的生物學效用。Walter等[2]發(fā)現(xiàn)S1P刺激EPCs后，CXCR4蛋白表達增強，EPCs的遷移和管型形成能力也增強，而該作用必須依賴于S1PR3的存在。

研究表明，S1PR3參與調節(jié)AS過程中損傷部位中性粒細胞和巨噬細胞的募集[1]，促進小鼠胚胎纖維母細胞生長和增殖[2]。然而，對于不同部位的vSMCs，S1PR3所發(fā)揮的生物學作用卻存在兩種完全相異的結果。Keul等[1]在使用頸動脈結扎模型時發(fā)現(xiàn)，WT小鼠血管內膜的損傷修復能力明顯優(yōu)于S1PR3-/-小鼠，這一結果顯示：S1PR3主要通過抑制vSMCs遷移、增殖，從而有效減少損傷后血管內膜的增生。而Shimizu等[3]使用髂-股動脈剝脫模型中意外的發(fā)現(xiàn)S1PR3-/-小鼠血管內膜的損傷修復能力明顯優(yōu)于WT小鼠，這一結果則顯示：S1PR3對損傷后血管內膜的增生起到了一定的促進作用。他們分析認為：小鼠頸動脈S1PR3表達較低，而髂-股動脈的S1PR3表達處于相對較高的水平，是導致兩種完全不同的實驗結果產生的主要原因。細胞表面S1PR3表達的高低，可能是引起S1PR3信號激活后不同功能的重要原因，因此制備S1PR3高表達的病毒載體，調高原本低表達的細胞受體，是否能改變細胞的功能，值得進一步探索。

目前，廣泛應用于基因治療和研究的載體主要可分為兩大類：即非病毒類和病毒類[4-5]。非病毒載體的轉染效率相對較低、且在體內表達不穩(wěn)定，因而應用受到較大限制。而病毒載體具有轉染效率高、可在病毒調節(jié)信號控制下表達外源治療基因、能分離外源基因等特點，應用較廣。其中逆轉錄病毒具備宿主細胞廣泛、對感染細胞毒性小、易有效整合入宿主細胞基因組，病毒顆?？杀粰C體免疫途徑降解、可與內源性病毒重組等特點，體外制備過程中易于獲取較高滴度的病毒液，既可以感染分裂期的細胞又可以感染非分裂期的細胞，臨床及實驗研究中應用非常廣泛。

本研究成功地使用第三代慢病毒載體系統(tǒng)構建了高表達小鼠的S1PR3的重組慢病毒載體，并成功收獲滴度較高的慢病毒。而將制備成功的S1PR3慢病毒感染小鼠L929細胞后，發(fā)現(xiàn)感染后的小鼠可以明顯明顯目的條帶表達，而感染空載體的細胞中，未見S1PR3表達，為進一步調控S1PR3相關的細胞功能奠定了基礎。

[1]Keul P,Lucke S,von Wnuck Lipinski K,et al.Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes recruitment of monocyte/macrophages in inflammation and atherosclerosis[J].Circ Res,2011,108(3): 314-323.

[2]Walter DH,Rochwalsky U,Reinhold J,et al.Sphingosine-1-phosphate stim μlates the functional capacity of progenitor cells by activation of the CXCR4-dependent signaling pathway via the S1P3 receptor[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27(2):275-282.

[3]Shimizu T,De Wispelaere A,Winkler M,et al.Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes neointimal hyperplasia in mouse iliac-femoral arteries[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(4): 955-961.

[4] Basner-Tschakarjan E,Bijjiga E,Martino AT.Pre-clinical assessment of immune responses to adeno-associated virus(AAV)vectors [J].Front Immunol,2014,5:28.

[5] Nair N,Kasai T,Seno M.Bacteria:Prospective savior in battle against cancer[J].Anticancer Res,2014,34(11):6289-6296.

Construction of the recombinant expression lentivirus vector carrying S1PR3 gene.

WANG Hang1,CAI Ke-yin1, HUANG Hao2.1.Second Department of Geratology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070, Hubei,CHINA;2.Clinical Medical Center,Shenzhen Hornetcorn Biotechnology Co.Ltd.Shenzhen 513000,Guangdong, CHINA

ObjectiveTo construct the recombinant lentivirus vector carrying sphingosine-1-phosphate receptor 3(S1PR3)gene.MethodsThe fragment of S1PR3 gene from the cDNA of the cardiac muscle of mouse was cloned into the lentivirus vector pLent-IRES-EGFP.Then the recombinant vector and the Packaging Mix were cotransfected into the 293T cells.Filtered culture media were harvested and the viral titer was checked by observing the expression of green fluorescent protein(GFP).Mouse L929 cells were infected with the lentivirus and the expression of the S1PR3 of the L929 cells was detected by the real time PCR.ResultsA 1 100 bp fragment was amplified from cDNA of mouse myocardial tissue.Then after double enzyme digestion,S1PR3 was successfully cloned into the lentiviral expression vector pLent-IRES-EGFP.Green fluorescence was observed 48 h after transfection into 293 cells. L929 cells were collected and cultured successfully,and S1PR3 was successfully expressed.ConclusionThe recombinant lentivirus vector carrying S1PR3 gene(pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP)with high expression of S1PR3 was constructed successfully in the mouse L929 cells successfully,laying basis for regulating S1PR3-related cell function.

Lentivirus;Sphingosine-1-phosphate receptor 3(S1PR3);Vascular injury;Reendothelialization

R-332

A

1003—6350（2015）18—2653—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0967

2015-03-09)

國家自然科學基金(編號：81300153)

黃 浩。E-mail：didigoe@163.com