孫曉東，呂國忠 *，欒雨時，陳 嶸，趙志慧

（1.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116600）

豆醬也稱黃豆醬或大豆醬，在我國北方地區(qū)俗稱大醬，是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，距今已有超過3 000年的歷史[1]。發(fā)酵豆醬保留了大豆本身的營養(yǎng)成分，增加了蛋白質(zhì)的含量，消除了胰蛋白酶抑制劑，并將大豆蛋白進(jìn)一步分解成人體所能直接吸收利用的小肽[2]，使得豆醬成為營養(yǎng)豐富、口味獨特、易于消化吸收的調(diào)味品。由于傳統(tǒng)的家庭自制豆醬是自然發(fā)酵而成，在完全開放式的制作過程中，空氣中的大量微生物自由落入，形成特殊的微生物區(qū)系，其中真菌伴隨在豆醬的整個制作過程，米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）等有益菌分解大豆蛋白，形成豆醬特有的風(fēng)味和營養(yǎng)[3]。

微生物蛋白酶是一類由微生物分泌到胞外用于降解一些難以利用的營養(yǎng)物質(zhì)的蛋白水解酶，目前應(yīng)用于干酪生產(chǎn)、肉類嫩化和植物蛋白改性等方面。在其的作用下，人體內(nèi)攝入的蛋白被水解成小分子肽和氨基酸[4]，如曲霉和毛霉是發(fā)酵食品生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的發(fā)酵菌種[5]。本研究對254份采自東三省各地的家庭自制豆醬進(jìn)行分離，獲得純培養(yǎng)真菌菌株389株，并用形態(tài)學(xué)分類將其鑒定到種[6-12]，明確了各菌株的分類地位。對這些菌株進(jìn)行了蛋白酶活性的篩選，通過平板透明圈法[13]、發(fā)酵復(fù)篩等獲得高產(chǎn)蛋白酶的菌株，并對其蛋白酶活性進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1%牛奶瓊脂培養(yǎng)基：10 g脫脂牛奶，20 g瓊脂，加水定容至1 000 mL，pH值自然；復(fù)篩培養(yǎng)基：煮熟大豆20 g，pH值自然；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

自然發(fā)酵豆醬：東三省各地的農(nóng)戶家；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、福林酚試劑（分析純）：上海索萊寶生物科技有限公司；酪氨酸：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

奧林帕斯CX21顯微鏡：日本奧林帕斯株式會社；Sigma2-16KL離心機：德國Sigma公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA2004型電子天平：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

用接種針將保存于凍存管里的各供試菌株接入新鮮的PDA平板中，25 ℃黑暗培養(yǎng)，待長出菌落后進(jìn)行菌株的初篩。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩

采用平板透明圈法進(jìn)行菌株初篩。在直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，注入15 mL脫脂牛奶培養(yǎng)基，待凝固成平板后，挑取單菌落接種于平板上，置25 ℃黑暗培養(yǎng)。記錄透明圈半徑，選取形成透明圈的菌株進(jìn)行復(fù)篩的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.3 發(fā)酵復(fù)篩

取煮熟的大豆20 g，置于150 mL三角瓶中，滅菌。將新鮮菌株制成濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取1 mL置于滅菌的大豆中，于25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d。

1.3.4 酶液的制備

將發(fā)酵15 d的大豆三角瓶從培養(yǎng)箱中取出，加入50 mL無菌的去離子水，分散均勻，30 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，靜置。濾液4 200 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液測定。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用福林酚法測定蛋白酶的活性。首先配制不同質(zhì)量濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，如表1所示。分別取不同質(zhì)量濃度酪氨酸1 mL，各加入0.4 mol/L碳酸鈉5 mL，F(xiàn)olin試劑工作液1 mL，搖勻置于水浴鍋中，40 ℃保溫發(fā)色20 min，用分光光度計在波長680 nm處測定吸光度值[14]。以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，酪氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 不同質(zhì)量濃度酪氨酸溶液的配制Table 1 Preparation of different concentration of tyrosine

1.3.6 蛋白酶活性測定

酶活定義：在一定pH值和40 ℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為一個蛋白酶活力單位，U。每個樣品做3個平行試驗，取平均值計算酶活力。計算公式如下：

式中：U為樣品的酶活力，μg/mL；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的酪氨酸溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；N為酶液的稀釋倍數(shù)；4為反應(yīng)試劑總體積，mL；10為反應(yīng)時間，min；V為酶液的總體積，mL。

反應(yīng)過程如下[14]：

從反應(yīng)過程可以看出，樣品和空白管中，酪蛋白和三氯乙酸（TCA）的加入順序不同，前者酪蛋白與待測酶液充分反應(yīng)，而后者先加入的TCA阻止了酶液和酪蛋白的反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，并得回歸方程：y=0.009 5x+0.000 8，其中y為吸光度值（OD680nm），x為酪氨酸質(zhì)量濃度。相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9，表明二者線性關(guān)系良好。

圖1 酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選結(jié)果

將分離自豆醬的389株真菌進(jìn)行脫脂牛奶平板透明圈法初篩，其中共有31株表現(xiàn)出蛋白酶活性，在培養(yǎng)基的背面形成了透明的水解圈。用福林酚法測定發(fā)酵復(fù)篩后的粗酶液，各菌株都表現(xiàn)出了不同程度的蛋白酶活性。各菌株的透明圈大小及酶活詳見表2。

表2 各菌株的透明圈大小及酶活力Table 2 The transparent zone diameter and protease activity of the stains

由表2可以看出，從豆醬上分離到的多種真菌都具有合成蛋白酶的能力，編號為JMHKA和JYSA的菌株蛋白酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌株，這兩株菌是分別采自吉林梅河口和吉林榆樹的米曲霉。米曲霉是公認(rèn)的食品安全菌株，具有很強的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在較廣的pH 范圍內(nèi)均具有活性，另外由于米曲霉含有豐富的糖苷水解酶，可以利用淀粉或纖維素等廉價原料高效生產(chǎn)蛋白酶，所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要來源菌株[15]。這兩株高酶活的米曲霉可以用于后續(xù)的蛋白酶的分離純化，及酶學(xué)性質(zhì)的研究。

表2中還有4株真菌在脫脂牛奶平板上產(chǎn)生了透明圈，表現(xiàn)出了蛋白酶活性，可在后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)中，粗酶液的酶活為負(fù)值。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，可能為福林酚法測酶活時，酶液與酪蛋白作用出現(xiàn)了問題，或者發(fā)酵培養(yǎng)的條件不適合菌株的生長，使菌株出現(xiàn)了生長停滯或者代謝遲緩等問題。

3 結(jié)論

試驗測得的透明圈大小與粗酶液的酶活力并不完全成正相關(guān)，究其原因，可能為脫脂牛奶平板的營養(yǎng)狀況和培養(yǎng)條件并不是某些菌株適宜的生長條件，因此出現(xiàn)了透明圈半徑小，而發(fā)酵液酶活大的情況。由此可以得出，如果僅僅依靠初篩的透明圈半徑來篩選強酶活的菌株是不精準(zhǔn)的，建議對產(chǎn)生透明圈的菌株都應(yīng)該進(jìn)行復(fù)篩發(fā)酵。

用脫脂牛奶平板對分離到的389株真菌進(jìn)行蛋白酶活性的初篩，得到了31株產(chǎn)生透明水解圈的菌株，其中曲霉屬的真菌12株、青霉5株、毛霉4株、鐮孢菌3株、帚霉1株、芽枝孢3株、犁頭霉1株、紅曲2株。曲霉屬的真菌無論從數(shù)量還是酶活都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他屬的真菌，是豆醬發(fā)酵過程中分解大豆蛋白的主要功能菌株。其他屬的真菌也具有或高或低的蛋白酶合成能力，在豆醬的發(fā)酵中應(yīng)該是多菌株混合發(fā)酵，相互協(xié)同，共同將大豆蛋白降解。

[1]WOOD B J B.發(fā)酵食品微生物學(xué)[M].徐 巖譯.北京：中國輕工業(yè)出版社，2001.

[2]HONG K J,LEE C H,KIM S W.Aspergillus oryzaeGB-107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybean meals[J].J Med Food,2004,7(4):430-435.

[3]牛天嬌，馬 鶯.中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中微生物的發(fā)掘與利用[J].中國釀造，2005，24（2）：1-5.

[4]崔東善.蛋白酶及其在食品中的應(yīng)用[J].杭州食品科技，1997（1）：15-16.

[5]張巧云.豆醬中微生物多樣性及人工接種多菌種發(fā)酵豆醬的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2013.

[6]DOMSCH K H,GAMS W,ANDERSON T H.Compendium of soil fungi[M].London:Academic Press,1980.

[7]KLICH M A,PITT J I.A laboratory guide to commonAspergillusspecies and their teleomorphs[M].Australia:Division of Food Processing,1994.

[8]PITT J I.The genusPenicilliumand its teleomorphic statesEupenicilliumandTalaromyces[M].London:Accademic Press,1979.

[9]PITT J I.A Laboratory guide to commonPenicilliumspecies[M].Australia:Division of Food Processing,1988.

[10]KUBICEK C P,HARMAN G E.TrichodermaandGliocladium[M].London:Taylor and Francis Ltd,1998.

[11]KIRK P M,CANNON P F,DAVID J C,et al.Dictionary of the fungi,9th Edition[M].London:CABI Publishing,2001.

[12]BRAYFORD D.The identification ofFusariumspecies[M].UK:International Mycological Institute,1993.

[13]張樹政.酶制劑工業(yè)[M].北京：科學(xué)出版社，1998.

[14]陳 嶸.我國部分地區(qū)自然發(fā)酵豆醬中真菌的多樣性和真菌毒素的檢測[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2008.

[15]馬俊陽，諸葛斌，方慧英，等.米曲霉蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報，2014，41（1）：83-89.