席曉圓，張 鵬*，向振坤，白 龍，宋發(fā)軍

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074）

葡萄酒是以鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的，酒精度不低于7.0%vol的酒精飲品。葡萄皮中含有的白藜蘆醇對預(yù)防癌癥等有著顯著的療效[1]。葡萄酒性溫味甘，具有養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚、抗衰抗輻射、消除疲勞、止血利尿的功效，對預(yù)防心臟病、壞血病、貧血，降低血脂等具有一定的幫助[2-3]。武陵山區(qū)野生葡萄資源豐富，當(dāng)?shù)囟嘤星锛咀葬勂咸丫频牧?xí)慣，屬于地方特色風(fēng)味飲品之一。自釀葡萄酒具有方法簡單、不使用食品添加劑、價(jià)格便宜、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，因此，頗受當(dāng)?shù)孛癖姎g迎。但由于原材料葡萄和加工工藝會(huì)對自釀葡萄酒的質(zhì)量有影響（如葡萄的品種、質(zhì)量與種植環(huán)境等），因而存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要對自釀葡萄酒的理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)等進(jìn)行檢測，對其飲用安全進(jìn)行評價(jià)。

該文采用密度瓶法、氣相色譜法和原子吸收分光光度法等方法對自釀葡萄酒的酒精度、干浸出物、甲醇和重金屬、總酸度、總糖、菌落總數(shù)及致病菌等指標(biāo)進(jìn)行檢測，評價(jià)自釀葡萄酒的相關(guān)指標(biāo)是否符合安全飲用標(biāo)準(zhǔn)，從而為開發(fā)武陵山區(qū)地方特色風(fēng)味飲品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料葡萄酒采集自湖北省恩施州巴東縣的茶店子鎮(zhèn)店子坪村。

甲醇（色譜純）：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

真菌和細(xì)菌的分離和培養(yǎng)分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）和LA培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分及配制方法見文獻(xiàn)[4]。細(xì)菌分子鑒定采用16S rDNA引物（F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

可溶性糖測定試劑盒：蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SP-2100A氣相色譜儀：北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；AA-6300原子吸收分光光度計(jì)：日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的釀制

原料葡萄挑選→清水浸泡10～30 min→葡萄捏碎（葡萄皮戳破即可）→葡萄∶糖=10∶1的比例加糖（糖分兩次添加：第一次在裝入葡萄后24 h加入，剩余的糖在3～4 d后視發(fā)酵情況加入）→密封→18～20 ℃發(fā)酵→渣液分離→過濾→后發(fā)酵大約30 d后啟封→15～20 ℃自然陳釀。

1.3.2 總酸的測定

參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行NaOH標(biāo)液的標(biāo)定及樣品總酸的測定。葡萄酒的總酸計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品中滴定酸的含量，g/L；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V0為空白對照消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V1為樣品滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為檢測樣品體積，mL；0.075為與1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜乃岬馁|(zhì)量。

1.3.3 酒精度的測定

參照文獻(xiàn)[6-7]的密度瓶法進(jìn)行酒精度的測定，葡萄酒餾出液在20 ℃時(shí)的密度計(jì)算公式如下：

根據(jù)酒樣蒸餾液在20 ℃時(shí)的密度，可從酒精水溶液密度與酒精度對照表（20 ℃）中查得試樣中酒精含量的體積百分?jǐn)?shù)，以%vol表示。

1.3.4 總糖（以葡萄糖計(jì)）的測定

使用可溶性糖測定試劑盒進(jìn)行總糖的測定。計(jì)算公式如下：

式中：A為波長620 nm條件下的吸光度值；W為取樣的體積，mL；X為總糖含量，g/L。

1.3.5 干浸出物的測定[8-9]

使用1.3.3中蒸出酒精后的殘液，在20 ℃時(shí)用水定容至100 mL。并按密度瓶法測定酒精度，分析步驟同1.3.3操作，依據(jù)密度瓶法測定酒精度的密度。由計(jì)算公式計(jì)算出脫醇樣品20 ℃時(shí)的密度ρ1，以ρ1×1.001 8的值查詢密度-總浸出物含量對照表，得出總浸出物含量，g/L。根據(jù)干浸出物=總浸出物-總糖+0.05×還原糖，得出干浸出物的含量。

1.3.6 甲醇的測定

用于檢測葡萄酒中甲醇含量的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇水溶液為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0.1 g/L的甲醇（色譜純）標(biāo)準(zhǔn)溶液。

依據(jù)文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道的方法進(jìn)行樣品的制備。色譜條件：5%OV-101石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 m），載氣氮?dú)?，流?00 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，進(jìn)樣量0.5 μL，柱溫50 ℃，檢測器溫度120 ℃，氣化室溫度120 ℃，分別檢測0.1 g/L的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，甲醇含量的計(jì)算公式如下：

社會(huì)形態(tài)的發(fā)展是合規(guī)律性的自然歷史過程與合目的性的主體自覺選擇過程的統(tǒng)一。我國現(xiàn)階段主導(dǎo)性與多樣性相統(tǒng)一的社會(huì)生態(tài)化治理基本范式，也是在主客觀條件共同作用下歷史地形成的。

式中：C為樣品甲醇質(zhì)量濃度，g/L；Cs為標(biāo)準(zhǔn)品甲醇質(zhì)量濃度，g/L；A為樣品甲醇峰面積；As為標(biāo)準(zhǔn)品甲醇峰面積。

1.3.7 重金屬的測定

依據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行自釀葡萄酒樣品的處理，并用體積分?jǐn)?shù)2%的硝酸溶液配制質(zhì)量濃度分別為0、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL的鎘和鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液送至中南民族大學(xué)分析測試中心采用原子吸收分光光度法進(jìn)行葡萄酒中鎘和鉛含量的檢測。

1.3.8 菌落總數(shù)的測定

依據(jù)參考文獻(xiàn)[13]將酒樣用無菌水分別稀釋10、100倍后，分別涂于LA和PDA平板，LA平板于37 ℃培養(yǎng)48 h，PDA平板于28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)菌和真菌生長的結(jié)果，并用直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.3.9 細(xì)菌的分類及鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 自釀葡萄酒的感官評價(jià)

自釀葡萄酒的顏色為玫瑰紅色；沒有懸浮物，清亮透明；具有純凈、怡人的果香；甜、酸、澀比較協(xié)調(diào)。

2.2 總酸的測定

雖然國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15037—2006《葡萄酒》對葡萄酒的總酸不作要求，但葡萄酒的總酸含量會(huì)影響其口感。該文對自釀葡萄酒樣品的總酸進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。由表1可知，其平均總酸約為5.15 g/L。

表1 自釀葡萄酒樣品的總酸測定結(jié)果Table 1 Determination results of total acidity of home-brewed wine

2.3 酒精度的測定

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15037—2006《葡萄酒》中要求的葡萄酒的酒精度不得低于7%vol，對自釀葡萄酒樣品酒精度進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，酒樣餾出液在20 ℃時(shí)的密度為988.118 2 g/L，經(jīng)查酒精水溶液密度與酒精度對照表（20 ℃）得其酒精度為8.66%vol～8.68%vol，符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

表2 自釀葡萄酒樣品的酒精度Table 2 Determination results of alcohol content of home-brewed wine

2.4 總糖含量

采用總糖檢測試劑盒對樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。由表3可知，自釀葡萄酒的總糖含量為24.08 g/L，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15037—2006《葡萄酒》的要求，該葡萄酒酒屬于平靜葡萄酒中的半甜葡萄酒（12.1～45.0 g/L）。

表3 葡萄酒樣品的總糖Table 3 Determination results of total sugar of home-brewed wine

2.5 干浸出物含量

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15037—2006《葡萄酒》要求，葡萄酒中干浸出物的含量≥18.0 g/L。檢測自釀葡萄酒中干浸出物的含量見表4。由表4可知，葡萄酒中干浸出物平均含量為22.42 g/L，符合國標(biāo)要求。

表4 葡萄酒樣品的干浸出物Table 4 Determination results of dry extracts of home-brewed wine

2.6 甲醇含量

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15037—2006《葡萄酒》要求，葡萄酒的甲醇含量≤400 mg/L。采用氣相色譜檢測自釀葡萄酒的甲醇含量，其標(biāo)準(zhǔn)品（甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液）和樣品色譜見圖1。

圖1 甲醇標(biāo)準(zhǔn)品(A)與自釀葡萄酒樣品(B)的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatography of methanol standard (A) and home-brewed wine sample (B)

圖1（A）中0.890 min處的峰為甲醇。1.398 min處的峰為乙醇。其標(biāo)準(zhǔn)溶液的甲醇峰面積As為1 816 932.488，樣品峰面積A為1 843 351.736，標(biāo)準(zhǔn)溶液的甲醇質(zhì)量濃度Cs為0.1 g/L，經(jīng)方法1.3.5中公式計(jì)算得自釀葡萄酒中甲醇含量為101.45 mg/L，符合國標(biāo)要求。

2.7 鎘和鉛的含量

原國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2758—2005《發(fā)酵酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定鉛≤0.2 mg/L，而在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2758—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》、國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15037—2006《葡萄酒》中沒有規(guī)定鉛的限量指標(biāo)，而且GB 2758—2012和GB 15037—2006對鎘含量沒有要求，但國際葡萄與葡萄酒組織（organisation internationale de vigne et du vin，OIV）對葡萄酒中鉛、鐵、銅、鎘、鋅、砷、鈉7種金屬含量都有要求[13]。采用原子吸收分光光度法檢測自釀葡萄酒中鎘和鉛含量的結(jié)果（表5）表明，自釀葡萄酒中鎘和鉛的含量甚微，分別為3.22 μg/L、40 μg/L，對人體健康不會(huì)造成危害。

表5 自釀葡萄酒樣品的鎘和鉛含量Table 5 The Cd or Pb content of the home-brewed wine

2.8 微生物檢測

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2758—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》規(guī)定葡萄酒中的菌落總數(shù)≤50 CFU/mL。自釀葡萄酒中菌落總數(shù)的檢測結(jié)果見表6。自釀葡萄酒中沒有分離出真菌（PDA平板無真菌生長）；而1 mL自釀葡萄酒原液在37 ℃培養(yǎng)48 h的條件下，細(xì)菌菌落總數(shù)平均值為10 CFU/mL，符合GB 2758—2012標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。對從4 mL葡萄酒中分離的40株細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)均為革蘭氏陽性菌。之后，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征將其分成不同的組，并隨機(jī)選擇具有明顯差異的10株細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增以及分析，結(jié)果（表7）表明，各有3株細(xì)菌屬于枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，各有2株屬于蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌；未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌及金黃色葡萄球菌等致病菌，符合國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2758—2012）的要求。

表6 自釀葡萄酒樣品的細(xì)菌菌落總數(shù)Table 6 Total plate count of the home-brewed wine

表7 分離自釀葡萄酒樣品的細(xì)菌的分類Table 7 Classification of the strains isolated from the home-brewed wine

3 結(jié)論

自釀葡萄酒營養(yǎng)價(jià)值豐富且釀制方法簡單，不添加任何食品添加劑，靠葡萄自身攜帶的酵母菌自然發(fā)酵而成[15]。原材料葡萄的生長環(huán)境及自釀工藝等，會(huì)影響自釀葡萄酒質(zhì)量與安全，比如土壤環(huán)境會(huì)影響葡萄中重金屬和微生物的含量，自釀工藝會(huì)影響葡萄酒中的甲醇含量[16]，這些會(huì)導(dǎo)致自釀葡萄酒飲用的不安全性。

鑒于對武陵山區(qū)地方特色飲品的開發(fā)，本研究采集了當(dāng)?shù)氐淖葬勂咸丫?，運(yùn)用密度瓶法、氣相色譜法、原子吸收分光光度法、酸堿滴定法及微生物培養(yǎng)法對自釀葡萄酒的酒精度、干浸出物、甲醇、重金屬、總酸度、菌落總數(shù)及致病菌等指標(biāo)進(jìn)行了檢測，根據(jù)國際葡萄和葡萄酒組織（OIV）規(guī)定以及國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 15037—2006、GB 2758—2012）對其安全性進(jìn)行了初步的評價(jià)：酒精度、干浸出物、甲醇、總酸、菌落總數(shù)和致病菌等指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。并根據(jù)該葡萄酒中總糖的含量，將該葡萄酒劃分為平靜葡萄酒中的半甜葡萄酒。結(jié)果表明，武陵山區(qū)茶店子鎮(zhèn)的自釀葡萄酒色澤紅艷清亮、香甜怡人、酸澀比較協(xié)調(diào)，檢測指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，可作為一項(xiàng)飲用安全的具有開發(fā)潛力的地方特色飲品。

[1]初 明，魏蘭蘭，胡志強(qiáng).白黎蘆醇的化學(xué)防癌作用及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國新藥與臨床雜志，2005，24（3）：235-238.

[2]繆粉英.自制葡萄酒的釀造技術(shù)及其保健功效[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：249-250.

[3]柴菊華，孫曉偉，崔彥志，等.HPLC 法測定葡萄酒中白藜蘆醇的含量[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（22）：106-110.

[4]張 鵬，劉 博，周蓬蓬，等.一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌YN6 的分離與鑒定[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2011，27（10）：961-967.

[5]黃丹丹，康貴吉，劉 鑫，等.不同酒類總酸度的測定與比較[J].廣西輕工業(yè)，2008，（11）：3-4.

[6]馬佩選.葡萄酒質(zhì)量與檢驗(yàn)[M].北京：中國計(jì)量出版社，2002.

[7]陸其科.高純度酒精蒸餾[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1992.

[8]陳維敏.葡萄酒中干浸出物的測定[J].中國釀造，1996，14（6）：30-31.

[9]于韶洋，吳兆翔.葡萄酒的主體骨架—干浸出物[J].葡萄栽培與釀酒，1998，18（3）：39-41.

[10]曾 游，丁 怡.葡萄酒中甲醇的氣相色譜測定方法的條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（8）：1029-1032.

[11]朱寶光，陳開屏.酒品中酒精度含量的測定-氣相色譜法[J].化工中間體，2014（12）：8-9.

[12]鄭曉杰，牟德華，葛 娜，等.赤霞珠干紅葡萄酒中重金屬含量分析[J].中國釀造，2011，30（3）：161-164.

[13]歲 源，吳曉軍，曹 俊，等.食品檢驗(yàn)中菌落總數(shù)的不確定度評定[J].疾病防治，2013，15（6）：6-8.

[14]張艷芳，賈彩鳳，何 燦，等.蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶產(chǎn)生菌的分離篩選和鑒定[J].食品工業(yè)科技，2015，36（1）：170-176.

[15]藺紅蘋，邱翠嬋，劉嘉玲.自釀葡萄酒的衛(wèi)生指標(biāo)和理化指標(biāo)的檢測[J].湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（3）：98-102.

[16]沈志毅，李記明，于 英，等.釀酒微生物和果膠酶對葡萄酒甲醇和雜醇油生成的影響[J].魯東大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，29（2）：155-158.