竇立靜，齊向濤

（1.新疆石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所，新疆 石河子 832003；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 新疆 石河子 832003）

新疆北疆豬偽狂犬病毒野毒的PCR檢測(cè)

竇立靜1，齊向濤2

（1.新疆石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所，新疆 石河子 832003；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 新疆 石河子 832003）

根據(jù)豬偽狂犬病毒（PrV）非必需糖蛋白gE基因特異引物，建立了針對(duì)PrV野毒的PCR檢測(cè)方法。利用該方法對(duì)采自北疆地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)的92份疑似病料進(jìn)行了檢測(cè)，PrV檢出率為40.2%(37/92)，表明該檢測(cè)方法敏感性、特異性較高，最低病毒檢出量約為0.25pg，可用于PrV野毒感染的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。對(duì)陽性病料PrV gE基因的特異性序列進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)有15個(gè)病料發(fā)生變異，經(jīng)DNAMAN分析其同源性高達(dá)98.3%，初步判斷這些野毒株仍屬于同一個(gè)基因型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了解新疆北疆地區(qū)豬偽狂犬病病毒的流行情況提供了理論依據(jù)。

偽狂犬病毒；PCR；gE基因；豬

偽狂犬病是家畜和野生動(dòng)物感染偽狂犬病毒（Pseudorabies virus,PrV）后引發(fā)的的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為特征的急性傳染病[1]。該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害十分嚴(yán)重，在豬群多呈爆發(fā)性流行，對(duì)妊娠母豬、初生仔豬、育肥豬和種豬均造成嚴(yán)重傷害[4,5]。該病目前已成為我國(guó)集約化豬場(chǎng)母豬繁殖障礙、仔豬死亡率高的主要病因之一[4,5]，嚴(yán)重影響了生產(chǎn)和良種繁育，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但是由于PrV存在潛伏感染和不定期散毒等特點(diǎn)，處于PrV潛伏感染期的豬沒有臨床表現(xiàn)，但可終身帶毒并排毒[2,3]，給該病的有效防治帶來一定困難，因此加強(qiáng)對(duì)PrV潛伏感染豬的篩查至關(guān)重要[6]。

gE基因是PrV的主要毒力基因，同時(shí)也是PrV體外感染和復(fù)制的非必需糖蛋白基因[1，7]。研究發(fā)現(xiàn)gE基因的缺失能夠降低病毒的嗜神經(jīng)毒性，但不影響免疫原性，是研制和開發(fā)PrV基因缺失疫苗的理想靶基因。目前，gE基因缺失弱毒苗的免疫接種已成為偽狂犬病有效防控的重要手段，英國(guó)、丹麥、荷蘭、比利時(shí)和美國(guó)等歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家通過使用該疫苗并結(jié)合相應(yīng)的監(jiān)測(cè)技術(shù)和管理措施，已基本實(shí)現(xiàn)了豬偽狂犬病的凈化[8]。我國(guó)自上世紀(jì)70年代中期開始廣泛使用gE基因缺失弱毒疫苗，有效減少了偽狂犬病給養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失，但該疫苗的使用也給PrV的野毒監(jiān)測(cè)帶來一定干擾，迫切需要建立一套敏感特異的能夠鑒別野毒和疫苗株的診斷方法，以保證及時(shí)發(fā)現(xiàn)和減少PrV的潛伏感染[9]。

通過對(duì)1200多個(gè)偽狂犬病野毒株的研究發(fā)現(xiàn)，gE基因普遍存在于這些野毒株中并穩(wěn)定表達(dá)，所以gE基因也是鑒別和診斷偽狂犬病毒野毒株和疫苗株的理想基因。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了針對(duì)gE基因的PCR和核酸探針等分子診斷方法[10]。本文基于gE基因序列特異引物，建立了針對(duì)PrV野毒的PCR檢測(cè)方法，并對(duì)北疆地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)的偽狂犬病疑似病料進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了PrV野毒感染的快速鑒別診斷；在此基礎(chǔ)上對(duì)陽性病料的gE基因序列進(jìn)行了測(cè)序分析，為了解目前流行于北疆地區(qū)的偽狂犬病毒基因型，有效預(yù)防和控制豬偽狂犬病流行提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

分別采自新疆石河子(21份)、烏魯木齊（17份）、哈密（15份）、克拉瑪依（15份）、奎屯（12份）和昌吉（12份）等北疆地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)疑似豬偽狂犬病樣組織共96份。豬偽狂犬病毒（PrV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒(PPV)陽性病料由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑

組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIZOL、PGEM-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、100 bp Ladder Marker購(gòu)自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)（見表1）

豬偽狂犬病毒gE基因序列特異引物參考文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)合成。根據(jù)GenBank公布的豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬細(xì)小病毒(PPV)基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物并由上海生工合成。

表1 引物序列

1.2.2 病毒DNA和cDNA模板的制備

病毒基因組DNA提?。豪媒M織基因組DNA提取試劑盒分別提取豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒病料DNA，用微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）測(cè)定DNA濃度。

病毒總RNA提取及cDNA合成：利用TRIZOL法分別提取豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病料RNA，通過1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。用微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）測(cè)定總RNA的OD260和OD280值，計(jì)算OD260/OD280比值以鑒定其純度，并進(jìn)行濃度測(cè)算。利用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成cDNA第一鏈。

1.2.3 豬偽狂犬病病毒PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

在PCR反應(yīng)體系中，選取DNA模板濃度和引物濃度為變化常量，其他因素不變進(jìn)行體系的優(yōu)化。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化主要是通過梯度PCR篩選最適退火溫度。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及目的條帶的回收測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，切膠回收，通過連接、轉(zhuǎn)化，克隆入pMD18-T載體。通過菌落PCR檢測(cè)，挑選陽性重組質(zhì)粒送交送交北京六合華大基因公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)。

1.2.5 PCR敏感性測(cè)定

測(cè)定所提取病料DNA的含量，進(jìn)行10-1～10-9的10倍系列稀釋，在擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系不變的情況下，分別以不同稀釋度的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的檢出情況。

1.2.6 PCR特異性測(cè)定

利用PCV2、PPV、PRRSV和CSFV特異引物，分別以PCV2、PPV陽性病料基因組DNA和PRRSV、CSFV陽性病料的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證模板DNA特異性。在此基礎(chǔ)上，利用設(shè)計(jì)的PrV gE基因引物分別對(duì)PrV、PCV2、PPV陽性病料的DNA和PRRSV、CSFV陽性病料的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物的特異性。

2 結(jié) 果

2.1 豬偽狂犬病毒PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

經(jīng)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的摸索和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定最適反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，上下游引物（10 μM）各1 μl，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）1 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)充至25 μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，61℃40 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增得到一條大小為298 bp（圖1）的特異性條帶，與預(yù)期大小相符。

圖1 豬偽狂犬病毒gE基因片段的PCR結(jié)果

2.2 PCR檢測(cè)的敏感性

分別取不同稀釋度的PrV DNA 2 uL，按2.1所述最適反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，以10-1～10-9稀釋的核酸產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR,均能擴(kuò)增出目的條帶（298 bp）,但亮度隨著稀釋倍數(shù)的增加而遞減。經(jīng)測(cè)算，gE基因的DNA最低檢出量為0.25 pg(圖2)。

圖2 豬偽狂犬病毒gE基因PCR的敏感性檢測(cè)

2.3 PCR檢測(cè)的特異性

使用PCV2、PPV、PRRSV和CSFV基因特異引物分別對(duì)PCV2、PPV感染病料DNA和PRRSV、CSFV感染病料cDNA進(jìn)行PCR和測(cè)序，結(jié)果分別擴(kuò)增出與預(yù)期一致的特異性條帶 （圖3）,其大小分別為424bp、250bp、460bp和325bp，表明這些模板具有特異性。隨后，利用PrV gE基因特異引物分別對(duì)PrV、PCV2、PPV陽性病料DNA和PRRSV、CSFV陽性病料的cDNA進(jìn)行PCR，電泳結(jié)果表明除PrV陽性病料DNA中擴(kuò)增出特異條帶外（圖4），其他均無條帶，引物特異性強(qiáng)。

圖3 PCV2、PPV的DNA和PRRSV、CSF擴(kuò)增

圖4 PrV、PCV2、PPV的DNA和PRRSV、CSF引物特異性檢驗(yàn)

2.4 92份疑似豬偽狂犬病樣PCR擴(kuò)增

利用豬偽狂犬病毒gE基因特異引物對(duì)92份疑似豬偽狂犬病樣進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示37份為陽性的病料，病料的陽性率分別為40.2%（圖5）。

圖5 疑似豬偽狂犬病樣的PCR檢測(cè)

2.5 測(cè)序結(jié)果與分析

將37份PCR檢測(cè)陽性病樣的gE序列的測(cè)序結(jié)果與NCBI登陸的PrV gE基因序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)有15份病樣序列存在堿基突變，用DNAMAN軟件對(duì)這15個(gè)突變序列進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性高達(dá)98.3%(圖6)，說明從這些來自北疆不同地區(qū)病料中檢測(cè)到的PrV仍屬于一個(gè)基因型。

圖6 基因序列對(duì)比

3 討 論

豬偽狂犬在我國(guó)近年來感染趨勢(shì)日益嚴(yán)重，該病在我國(guó)自1947年初次報(bào)道以來，在全國(guó)常有散發(fā)性的爆發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的危害，有的地區(qū)出現(xiàn)了豬偽狂犬病毒的變異，給該病的防控帶來了很大的威脅。偽狂犬病病毒的毒力是多基因控制的，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PrV糖蛋白有g(shù)M、gH、gE、gK、gL、gl、gC、gB、gD、gG和gN共11種[11]，不同的蛋白在病毒侵染過程中扮演了不同的角色，其中對(duì)病毒增殖來說非必需的糖蛋白有g(shù)M、gE、gl、gC和gG蛋白。 gE基因是PrV的主要毒力基因，對(duì)PrV在神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲和傳播起重要作用，其編碼的蛋白是病毒復(fù)制非必需糖蛋白[7]。由于gE基因在野毒株中能穩(wěn)定表達(dá)，其本身變異性不大，不同毒株的gE基因同源性很好，同時(shí)目前使用的基因缺失苗中基本不含該基因，因此普遍將gE基因作為PrV野毒鑒別診斷的標(biāo)記基因。本實(shí)驗(yàn)基于gE基因的PCR方法，用于偽狂犬病野毒的診斷經(jīng)臨床使用，效果較好。

PCR擴(kuò)增的特異性與引物密切相關(guān)，通常影響擴(kuò)增效率和目的條帶的擴(kuò)增。本研究以gE基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，通過對(duì)北疆地區(qū)92份疑似病料組織基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到37份陽性病料，同時(shí)對(duì)PCV2、PPV、PRRSV、CSF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。證明了引物的特異性，同時(shí)保證了PCR擴(kuò)增豬偽狂犬病病毒的可靠性。敏感性高，特異性好、快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)為PCR檢測(cè)技術(shù)在病毒疾病的診斷奠定了基礎(chǔ)。在 PrV模板 DNA的制備過程中，傳統(tǒng)的核酸提取方法，操作復(fù)雜、周期較長(zhǎng)，本試驗(yàn)應(yīng)用組織基因DNA提取試劑盒制備的PrV模板DNA，擴(kuò)增出預(yù)期298bp特異性片段。而且在進(jìn)行敏感性測(cè)定時(shí)，PCR的最低病毒檢出量約為0.25 pg。

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PCR Detection of Porcine Pseudorabies Virus Wild Strain in the Northern Xinjiang

DOU Li-jing,QI Xiang-tao
(1.Shihezi Veterinary Hygiene Quarantine Office,Shihezi 832003,China; 2.College of Animal Science&Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China.)

In present study,The PCR method focus on Pseudorabies Virus (PrV)wild virus was established based on the specific primers of PrV gE gene sequence.Using this method,92 suspected disease tissue collected from some large scale pig farms in the Northern Xinjiang were detected and the positive rate was 40.2% (37/92).The results show that this method is sensitive and specific,the lowest percentage of detection of PrV is 0.25pg,and can be used for rapid diagnosis and epidemiological investigation of PrV wild virus infection.Furtherly,the gE gene sequences of the PrV positive samples were blasted and analyzed,and the mutations were found in 15 samples.But the homology among the 15 sequences is higher up to 98.3%,which suggest that these wild virus strains still belong to a genetype.The study provide a theoretical basis to understand the epidemic status of the Porcine PrV in the Northern Xinjiang.

pseudorabies virus;PCR;gE gene;pig

S858.26

：A

：1003－6377（2015）05－0049-03

科技部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“邊境地區(qū)動(dòng)物疫病防控技術(shù)體系研究”（201103008）

竇立靜（1975-），女，漢族，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，從事獸醫(yī)臨床檢驗(yàn)工作。E-mail:dljww1170@sina.com

2015-07-13，

2015-07-20