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        液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測田七花總皂苷中三七皂苷R1的含量

        2015-04-02 09:11:59陳玉勇秦楓朱善元黃文強卞歡
        江蘇農(nóng)業(yè)科學 2014年12期
        關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜高效液相色譜

        陳玉勇 秦楓 朱善元 黃文強 卞歡

        摘要:建立了檢測田七花總皂苷中三七皂苷R1含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS方法。用BDS HYPERSUL C18(150 mm×21 mm,5 μm色譜柱,以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫,流速03 mL/min,柱溫30 ℃;質(zhì)譜分析采用三重四桿質(zhì)譜儀,多反應檢測(MRM模式,[JP2]電噴霧離子源(ESI負離子檢測,定量分析的離子為:三七皂苷R1 m/z 9317→7996,內(nèi)標物紫杉醇m/z 8525→5253。三七皂苷R1標準曲線的線性范圍為00476~119 μg/mL,平均加樣回收率為9933%,RSD為165%(n=6。精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均符合樣品分析的要求。

        關(guān)鍵詞:田七花;三七皂苷R1;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

        中圖分類號: Q94683+84;O65763文獻標志碼: A

        文章編號:1002-1302(201412-0319-03[HS][HT9SS]

        收稿日期:2014-07-07

        基金項目:江蘇省高校“青藍工程”科技創(chuàng)新團隊資助項目;江蘇省泰州市科技支撐(農(nóng)業(yè)計劃(編號:TL0719。

        作者簡介:陳玉勇(1978—,男,江蘇泰州人,博士研究生,講師,主要從事食品生物技術(shù)、食品分析等研究。E-mail:chenyuyong@tomcom。

        通信作者:秦楓,碩士,副教授,從事天然藥物及食品新資源開發(fā)等方向研究。E-mail:qinancy922@tomcom。

        田七花為五加科植物田七[Panax notoginseng (Burk FH]的干燥花蕾,田七花作為云南文山州的傳統(tǒng)生物資源,廣泛應用于食品、保健品以及中藥藥材。例如,當?shù)爻S锰锲呋ㄅ莶鑋1],制作點心,或與其他食材一起制成滋補品,長期食用對于治療高血壓、咽痛音啞和養(yǎng)生都頗有裨益[3-4]。田七花中含有皂苷、多糖、揮發(fā)油等多種化學成分,其中,皂苷是其主要生理活性成分,楊明晶等發(fā)現(xiàn)田七花苷沒有毒性作用[7],故近年來,將田七花進一步開發(fā)為保健品的研究較為熱門。Yang 等已經(jīng)從田七花中鑒定出170種單體皂苷,發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1是皂苷中的一種主要成分[8]。目前,關(guān)于田七花中三七皂苷R1含量檢測的方法有比色法[9]和HPLC法[10-11]等,但是比色法只能檢測其中總皂苷的含量,HPLC法運行時間一般在15 min以上,且靈敏度低、專屬性差。因此,筆者參照文獻[12]對試驗條件進行優(yōu)化,建立了 HPLC-MS/MS 分析方法,該法能夠靈敏地檢測田七花蕾中三七皂苷R1的含量,可為三七花總皂苷(SFPN和以其為主要成分的保健食品的含量檢測提供一定參考。

        1材料與方法

        11儀器

        三重四桿質(zhì)譜儀(API 4000型,配有電噴霧離子源(ESI,采用美國ABI公司的Analyst 141 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng);高效液相色譜儀(美國Agilent 1100;Q2200B型超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(浙江省金華市文華科教實驗儀器廠;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠;SH-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠;Direct-Q3型超純水機(江蘇省蘇州塞恩斯儀器有限公司。

        12對照品與試劑

        三七皂苷R1(批號:110745-201318,由中國藥品生物制品檢定所提供。紫杉醇(批號:100382-201201,購自云南省昆明科翔生物科技有限公司。田七干燥花蕾,由云南省文山壯族苗族自治州文山三七研究院提供。

        D101大孔樹脂購自江蘇省泰州醫(yī)藥公司。乙腈、甲醇為色譜純,水為超純水,其余均為分析純試劑。

        13HPLC-MS/MS分析條件

        131高效液相色譜條件

        色譜柱為 BDS HYPERSUL C18(150 mm×21 mm,5 μm;流動相為水(A和乙腈(B,流速為[CM(25][G5]03[G2]mL/min,柱溫為[G5]30[G2]℃,進樣量為[G5]10[G2]μL。梯度洗脫方[CM]

        [HS2]式為流動相B:20%[FY(]2 min[FY]30%[FY(]5 min[FY]75%[FY(]10 min[FY]90%。

        132質(zhì)譜條件

        采用電噴霧離子源(ESI負離子檢測,多反應檢測模式(MRM。設制離子噴霧電壓(IS為4 100 V;離子源霧化溫度(TEM為450 ℃;去集簇電壓(DP為-105 V;激發(fā)碰撞電壓(CE為-47 V。采用的定量分析離子為:三七皂苷R1 m/z 9317→7996;內(nèi)標物紫杉醇m/z 8525→5253。

        14樣品處理

        141對照品及內(nèi)標溶液的配制

        稱取三七皂苷R1 119 mg,[JP+1]以甲醇定容至10 mL,得到對照品儲備液。稱取紫杉醇101 mg,以甲醇超聲溶解,定容至10 mL,再取該溶液100 μL以甲醇定容至10 mL,渦旋振蕩溶解,即得內(nèi)標溶液。

        142供試品溶液的制備

        參照Sun等的方法[13],制備田七花總皂苷(SFPN。將田七干燥花蕾1 kg粉碎,過20目篩,以10倍質(zhì)量70%乙醇回流提取3次,每次提取15 h。合并提取液,減壓濃縮,并以適量水混懸,再分別以乙醚、正丁醇萃取,棄去醚層,收集正丁醇層,減壓濃縮,抽干溶劑。將正丁醇萃取物經(jīng)D101大孔樹脂先以水洗脫,棄去洗脫液,再以90%乙醇洗脫,收集洗脫液,于45 ℃左右減壓濃縮至干燥固態(tài),即為田七花總皂苷(SFPN。共制備了5個批次的SFPN(批號分別為20130502、20130816、20130902、20131011、20131112。

        稱取對應批號的SFPN粉末02 g,加甲醇定容至10 mL,超聲輔助溶解,得供試品儲備液。取內(nèi)標溶液100 μL和供試品儲備液100 μL,加甲醇定容至1 mL,渦旋振蕩溶解,經(jīng) 045 μm 微孔濾膜過濾,得供試品溶液。endprint

        2結(jié)果與分析

        21方法的專屬性和特異性

        按“13”節(jié)中液相色譜和質(zhì)譜條件對SFPN中三七皂苷R1進行測定,記錄色譜圖。圖 1為對照品和內(nèi)標物總離子流圖,圖2為SFPN和內(nèi)標物的總離子流圖。在選定色譜條件下,被分析的化合物三七皂苷R1和內(nèi)標物紫杉醇分別在約618 min和935 min時出峰,對照品和內(nèi)標物的峰形和分離度較好,靈敏度強;同時采用保留時間和離子對的響應強度來進行分析,更有效避免了其他物質(zhì)對這種皂苷測定的干擾,具有較好的專屬性和特異性。[FL]

        [F(W14][TPCYY1tif][F]

        [F(W14][TPCYY2tif][F]

        [FL(22]

        22標準曲線與線性范圍考察

        以對照品儲備液和內(nèi)標溶液來配制不同濃度對照品溶液,將三七皂苷R1的濃度分別調(diào)至0047、0119、0476、119、476、119 μg/mL,進樣量為10 μL。以對照品濃度為橫坐標,以樣品峰和內(nèi)標峰面積之比為縱坐標,制作回歸曲線,用加權(quán)(W=1/C2最小二乘法進行回歸分析[14],求得直線回歸方程為y=33x+0027 8,相關(guān)系數(shù)(r為0999 8,線性范圍為0047 6~119 μg/mL。

        23精密度試驗

        對照品溶液連續(xù)六針進樣,每次進樣10 μL,進行精密度試驗。計算對照品的峰面積和內(nèi)標峰面積的比值,并統(tǒng)計出比值的RSD為185%,表明儀器精密度較好。

        24穩(wěn)定性試驗

        量取供試品溶液10 μL,分別在0、8、16、24 h時進樣測定,計算對照品峰面積和內(nèi)標峰面積的比值,并統(tǒng)計出比值的RSD為193%,表明在24 h之內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性較好。

        25重現(xiàn)性試驗

        取批號為20130902的SFPN樣品,制備6份供試品溶液,[JP2]按“13”節(jié)的條件對樣品中三七皂苷R1的含量進行檢測。計算出樣品的峰面積和內(nèi)標峰面積的比值,并代入“22”節(jié)的回歸方程,計算出三七皂苷R1的平均含量為056 mg/g,并統(tǒng)計出含量的RSD為159%,表明本方法具有較好的重現(xiàn)性。

        26加樣回收率試驗

        稱取批號為20131011的已知含量的SFPN樣品6份,每份02 g,按上述方法,制備樣品儲備液,取100 μL內(nèi)標溶液和100 μL的供試品儲備液,加入適量的對照品儲備液,加甲醇定容至1 mL,溶解后,過045 μm微孔濾膜,得到供試品溶液,按上述方法操作,計算供試品溶液中三七皂苷R1的含量,計算回收率和RSD,結(jié)果見表1。

        [F(W10][HT6H][J][WTH]表1三七皂苷R1的回收率測定結(jié)果(n=6[HTSS][STB][WTB]

        [HJ5][BG(!][BHDFG3,W3,W42。5,W32W]樣品號稱樣量(mg樣品含量(μg/mL加入量(μg/mL測得量(μg/mL回收率(%RSD(%

        [BHDG12,W3,W42。5DW,W32W]1200111121122209821

        [BHDW]22000611211222810179

        320026112112229821

        4200151121122229911

        51999211211222610089

        6199791121122199777

        平均9933165[HJ][BG)F][F)]

        27樣品含量測定

        稱取不同批號的SFPN樣品3份,每份02 g,制備供試品溶液,按“13”節(jié)色譜條件進行操作,計算出樣品的峰面積和內(nèi)標峰面積的比值,并代入“22”節(jié)的回歸方程,計算三七皂苷R1含量,結(jié)果見表2。

        [F(W6][HT6H][J][WTH]表2田七花總皂苷中三七皂苷R1的含量(n=3[HTSS][STB][WTB]

        [HJ5][BG(!][BHDFG12,W14,W15W]SFPN批號三七皂苷R1(mg/g

        [BHDG12]20130502057

        [BHDW]20130816055

        20131112051[HJ][BG)F][F)]

        3討論

        田七花的組成成分復雜,含有大量色素,在測定三七皂苷R1時,必須排除主要基質(zhì)成分或色素成分的干擾。本研究參照Sun等所述方法[13],以乙醚萃取去除葉綠素等脂溶性物質(zhì),以正丁醇萃取出大部分的皂苷類物質(zhì),再選用D101型大孔樹脂進行柱層析,用水洗去多糖,最后收集90%乙醇洗脫液,此法可較好地對田七花皂苷類成分進行富集和純化。

        三七皂苷R1的最大吸收波長為203 nm,由于SFPN含有多種成分,紫外末端吸收多,采用普通的HPLC紫外檢測器難以進行高靈敏度的檢測,且專屬性較差。皂苷類化學成分極性大、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定,經(jīng)典的電子轟擊電離(EI對其進行結(jié)構(gòu)分析也很困難。使用ESI同時結(jié)合二級質(zhì)譜分析,可以較快地獲得結(jié)構(gòu)信息。在選定內(nèi)標物時,發(fā)現(xiàn)紫杉醇純度高、易保存,與被測成分的化學性質(zhì)相似,有較好的質(zhì)譜響應,穩(wěn)定性好,內(nèi)源物質(zhì)無干擾。本研究建立的采用負離子多反應監(jiān)測技術(shù)的HPLC-MS/MS分析方法,靈敏度高、重現(xiàn)性好,符合食品樣品分析的要求,較其他方法節(jié)省了大量的時間和成本[14],可用于三七皂苷R1的定量分析,為不同田七花及其保健食品、藥品的含量測定提供方法學參考。

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