趙廷坤，王志東，劉風嬌，曲梅花，高志芹

(濰坊醫(yī)學院應用藥理學山東省高校重點實驗室，濰坊醫(yī)學院藥理學教研室，山東濰坊261053)

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TNBS誘導炎癥性腸病大鼠結腸神經元tau蛋白磷酸化以及COX-2表達的變化*

趙廷坤，王志東，劉風嬌，曲梅花△，高志芹△

(濰坊醫(yī)學院應用藥理學山東省高校重點實驗室，濰坊醫(yī)學院藥理學教研室，山東濰坊261053)

［摘要］目的:探討三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)誘導炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)模型大鼠結腸神經元tau蛋白磷酸化和環(huán)氧合酶2(COX-2)表達的變化。方法: 30只健康雄性成年Wistar大鼠隨機分為對照組、IBD模型組和TNBS組，每組10只，IBD模型組以TNBS乙醇連續(xù)灌腸14 d造模，對照組和TNBS組分別以等量生理鹽水和TNBS灌腸;觀察大鼠的一般情況和結腸病理組織學改變，用anti-Hu作為神經元標志以免疫熒光法檢測結腸黏膜下神經元的數量變化，免疫熒光雙染色檢測結腸黏膜下神經元COX-2和磷酸化tau231、tau262的表達變化。結果:與對照組比較，IBD模型組大鼠結腸黏膜下神經元數量明顯減少(P＜0.05)，神經元tau蛋白磷酸化程度明顯升高(P＜0.05)，而TNBS組大鼠神經元數量與對照組相比無顯著差別;對照組和TNBS組大鼠結腸黏膜下神經元幾乎不表達COX-2，IBD模型組大鼠結腸神經細胞胞核和胞漿中均有COX-2的表達，與對照組和TNBS組相比有顯著差異(P＜0.05)。結論: TNBS乙醇誘導IBD模型大鼠結腸黏膜下神經元減少，可能與tau蛋白高度磷酸化及COX-2表達有關。

［關鍵詞］炎癥性腸病; Tau蛋白;環(huán)氧合酶2;腸神經系統

［修回日期］2015-03-19

Changes in phosphorylation of tau protein and COX-2 expression in colon submucosal neurons of IBD model rats induced by TNBS

ZHAO Ting-kun，WANG Zhi-dong，LIU Feng-jiao，QU Mei-hua，GAO Zhi-qin
(Key Lab of Applied Pharmacology in Universities of Shandong，Department of Pharmacology，Weifang Medical University，Weifang 261053，China.E-mail: qumeihua@ hotmail.com; zhiqingao@ wfmc.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the change of phosphorylation of tau protein and expression of cyclooxygenase 2 (COX-2) in colon submucosal neurons of enteric nerve system in inflammatory bowel disease (IBD) rats induced by trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).METHODS: Male rats (n=30) were randomly assigned to 3 groups (n=10 each) : control group，IBD group and TNBS group.The IBD rats were induced by TNBS+ ethanol enema for 14 d.The control and TNBS rats were given an equal volume of saline and TNBS，respectively.The general situation and the histopathologic change of the rat colon were observed.Immunofluorescence was used to check the change of phosphalated tau protein and COX-2 expression in the submucosal neurons of the colon.The expression of COX-2 and phosphorylated tau231 and tau262 in the rat colon submucosal neurons was observed by double immunofluorescence staining.RESULTS: Compared with control group，the number of neurons in the colon of IBD rats decreased obviously and the expression of phospholated tau231 and tau262 was significantly increased.The number of neurons in the colon of TNBS rats showed no significant difference compared with control rats.The rat neurons in control group and TNBS group did not express COX-2.COX-2 expression was observed in the nucleus and cytoplasm of colonic neurons in IBD rats，which showed significantly different from control and TNBS rats.CONCLUSION: The decreased neurons in the enteric nerve system of IBD rats might be associated with the phosphorylation of tau protein and the expression of inducible COX-2.

［KEY WORDS］Inflammatory bowel diseases; Tau protein; Cyclooxygenase 2; Enteric nervous system

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，可有腹瀉、腹痛、便血、體重減輕等表現，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確［1］。研究表明IBD中腸神經系統結構和功能表現異常，IBD患者腸黏膜中腸神經元的數目明顯減少［2］，在三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)結腸炎大鼠模型也有腸道神經元數目減少，炎性損害往往出現在黏膜下層，因此黏膜下神經元數目減少更為明顯［3］，但是IBD引起的腸道神經元數目減少的機制目前還不清楚。本研究通過制備TNBS乙醇誘導IBD大鼠結腸黏膜下神經叢鋪片標本，采用免疫熒光法，分別對腸神經元總數、磷酸化tau231和tau262免疫反應陽性神經元、環(huán)氧合酶2 (cyclooxygenase 2，COX-2)進行定量分析，評估IBS大鼠結腸黏膜下神經元變化與COX-2、磷酸化tau之間的關系。

材料和方法

1動物

SPF級Wistar大鼠，6～8周齡，體重250～350 g，雄性，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物室提供，許可證號為SCXK魯20 080 002。

2主要試劑

TNBS購自Sigma;大鼠anti-Hu抗體購自Molecular Probes;兔anti-tau(pT231)和anti-tau(pS262)抗體購自Life Technologies;兔膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase，ChAT)抗體、兔COX-2抗體、羊抗兔IgG-FITCⅡ抗、羊抗大鼠IgG-FITCⅡ抗和羊抗兔IgG-Cy3Ⅱ抗均購自武漢博士德生物工程有限公司;山羊血清購自北京中杉金橋生物技術有限公司;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3主要方法

3.1 TNBS乙醇誘導IBD大鼠模型的制備［4］取Wistar大鼠，術前禁食24 h，自由飲水，乙醚輕微麻醉后，用硬膜外麻醉導管經肛門輕緩地插入8 cm，深達結腸，然后快速注射50 mg/kg的TNBS乙醇溶液(5% TNBS溶液與等體積無水乙醇混合)。每天1次，連續(xù)14 d;對照組和TNBS組分別以等量生理鹽水和TNBS灌腸。

3.2大鼠結腸黏膜下神經叢(submucosal plexus，SMP)鋪片標本的制備本實驗方法參見文獻［5］，鋪片標本進行免疫熒光檢測。

3.3結腸黏膜下神經元檢測SMP標本，室溫下DMSO浸洗，PBS清洗，0.1%硼氰化鈉溶液浸洗，PBS再次清洗后將標本置于10%山羊血清中室溫孵育2 h，加入anti-HuⅠ抗4℃過夜，PBS漂洗后加羊抗大鼠IgG-FITCⅡ抗，室溫避光2 h，PBS漂洗后將標本展開平鋪于載玻片上，甘油封片。

3.4Anti-Hu抗體與anti-tau (pT231)和anti-tau (pS262)抗體免疫熒光雙染色檢測大鼠anti-Hu染色同上，然后分別加兔anti-tau(pT231)和anti-tau (pS262)抗體4℃過夜; PBS漂洗后加羊抗兔IgGCy3Ⅱ抗，室溫避光2 h。PBS漂洗后將標本完全展開平鋪于載玻片上，甘油封片，加蓋玻片，熒光顯微鏡檢查。

3.5 Anti-Hu抗體與COX-2抗體免疫熒光雙染色檢測大鼠anti-Hu染色同上，然后滴加兔COX-2Ⅰ抗4℃過夜。PBS漂洗后加羊抗兔IgG-Cy3Ⅱ抗，室溫避光2 h，PBS漂洗后將標本完全展開平鋪于載玻片上，甘油封片，加蓋玻片。

3.6 ChAT抗體與COX-2抗體免疫熒光雙染色檢測

制作好的的標本置于室溫PBS中清洗，將標本置于10%山羊血清中室溫下孵育2 h，加入兔ChATⅠ抗4℃過夜，PBS漂洗后加羊抗兔IgG-FITCⅡ抗，室溫避光2 h，PBS漂洗后滴加兔COX-2Ⅰ抗4℃過夜。PBS漂洗后加羊抗兔IgG-Cy3Ⅱ抗，室溫避光2 h，PBS漂洗后將標本完全展開平鋪于載玻片上，甘油封片，加蓋玻片。

3.7鋪片標本神經元計數方法每只大鼠取3張鋪片標本，置于熒光顯微鏡下，每張標本隨機計數8個不重合低倍視野，分別計數anti-Hu染色陽性神經元總數，雙染第二種特異抗體陽性神經元總數。

4統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1一般情況和病理組織學改變

對照組和TNBS組大鼠大便、飲食、體重、毛發(fā)光澤度、活動度和精神狀態(tài)良好。IBD模型組大鼠在造模后均出現腹瀉和稀便，并伴食欲和體重下降，毛發(fā)干枯，懶動，部分出現黏液膿血便。病理組織學，IBD模型組大鼠可見結腸黏膜充血、水腫、糜爛，并伴潰瘍形成(結果未顯示)。

2 TNBS乙醇誘導IBD大鼠結腸黏膜下神經元減少

Anti-Hu免疫熒光染色結果顯示，對照組大鼠結腸黏膜下神經元數為(12.3±3.3) mm－1，IBD模型組為(8.7±2.6) mm－1，TNBS組為(11.9±2.8) mm－1，對照組、TNBS組與IBD模型組之間有顯著差異(P＜0.05)，TNBS組與對照組之間無顯著差異，見圖1。

Figure 1.The expression of Hu protein and the neuron number in rat colonic submucosal plexus (immunofluorescence staining).Scale bars=50 μm.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control and TNBS.圖1大鼠結腸黏膜下神經元Hu蛋白免疫組化染色結果

3 IBD大鼠結腸黏膜下神經元tau蛋白磷酸化水平明顯升高

免疫熒光雙標法比較正常大鼠和IBD模型大鼠結腸黏膜下神經元tau蛋白磷酸化程度與腸神經細胞數目的關系，實驗結果顯示，磷酸化tau蛋白tau231和tau262在正常和IBD大鼠結腸黏膜下神經元均有表達，并且IBD大鼠結腸黏膜下神經元磷酸化tau蛋白tau231和tau262的熒光強度明顯高于正常對照組，見圖2、3。

4 IBD大鼠結腸黏膜下神經細胞COX-2表達明顯升高

免疫熒光染色顯示，IBD大鼠結腸黏膜下神經元的胞核和胞漿均有誘導性COX-2的表達，(65.2± 4.8) %的anti-Hu免疫熒光染色陽性神經元表達COX-2，(66.7±4.6) %的ChAT免疫熒光染色陽性神經元表達COX-2，而對照組(結果未顯示)和TNBS組大鼠結腸黏膜下神經元幾乎不表達COX-2，這2組與IBD大鼠之間有顯著差異(P＜0.05)，見圖4。

Figure 2.Colocalization of phospholated tau (detected by antibody pT231) and Hu protein in the colon submucosal plexuses in rats.Scale bars=50 μm.圖2大鼠結腸黏膜下神經元anti-Hu抗體與anti-tau(pT231)抗體免疫雙染色結果

Figure 3.Colocalization of phospholated tau (detected by antibody pS262) and Hu protein in the colon submucosal plexuses in rats.Scale bars=50 μm.圖3大鼠結腸黏膜下神經元anti-Hu抗體與anti-tau(pS262)抗體免疫雙染色結果

Figure 4.The expression of COX-2 in rat colonic submucosal plexuses.Scale bars=20 μm.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control and TNBS.圖4大鼠結腸黏膜下神經元COX-2蛋白免疫熒光染色結果

討論

乙醇破壞大鼠的腸黏膜屏障，TNBS作為半抗原與腸道內蛋白結合成為全抗原，誘發(fā)機體產生免疫反應，引發(fā)結腸的炎癥［4］。本研究發(fā)現，TNBS單獨灌腸并不能誘導大鼠結腸的炎癥，而TNBS乙醇誘導的IBD模型大鼠有結腸炎的病理特征，同時結腸黏膜下神經元減少，神經元tau蛋白磷酸化程度升高，并且胞核和胞漿均有誘導性COX-2的表達，而正常大鼠結腸黏膜下神經細胞不表達COX-2。

核蛋白Hu是一組神經元特異性抗原，它可標記腸神經系統的神經細胞，抗Hu抗體可使腸神經細胞的胞體和胞核染色，而神經纖維包括觸突、樹突和細突均不被染色，故Hu蛋白免疫熒光染色可用于神經元計數［6］。本研究發(fā)現，TNBS乙醇誘導的IBD模型大鼠結腸黏膜下神經元減少，這與Sanovic等［3］的報道相一致。

COX-2屬誘導型環(huán)氧酶，在各種刺激因子及炎癥細胞因子等的作用下誘導表達，它使組織過量生成PGs，繼而PGs介導各種炎癥反應。Hendel等［7］研究發(fā)現活動性IBD病人結腸中有COX-2 mRNA的表達，且表達量隨炎癥程度的增加而增加; Roberts等［8］報道在IBD病人結腸上皮細胞和肌間神經叢COX-2表達均有增加。本研究發(fā)現IBD模型大鼠結腸黏膜下神經元COX-2表達明顯升高，對照組大鼠幾乎不表達; ChAT是乙酰膽堿合成的關鍵酶，可以特異性標記膽堿能神經元，本研究發(fā)現IBD模型大鼠結腸黏膜下膽堿能神經元COX-2表達也明顯升高，以上結果表明COX-2與TNBS誘導的IBD大鼠結腸黏膜下神經元減少有關。

Tau蛋白是一種微管相關蛋白，主要分布在中樞和外周神經的神經元軸突內［9］，在中樞神經系統，tau蛋白異常高度磷酸化會導致神經纖維纏結的形成及神經元變性［10］。本研究發(fā)現，TNBS乙醇誘導的IBD模型大鼠結腸黏膜下神經元tau蛋白Thr231和Ser262磷酸化程度升高，表明tau蛋白高度磷酸化與IBD大鼠結腸黏膜下神經元減少有關。

綜上所述，我們推測，TNBS乙醇溶液引起結腸免疫反應導致細胞因子釋放，從而激活并誘導COX-2的表達，可能使前列腺素合成增加，繼而激活tau蛋白的磷酸化酶或(和)抑制去磷酸化酶，使tau蛋白高度磷酸化，進而影響微管的穩(wěn)定性，使神經元變性，最終神經元數量減少，但是具體機制還待進一步研究。

［參考文獻］

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通訊作者△曲梅花Tel: 0536-8462466; E-mail: qumeihua@ hotmail.com;高志芹Tel: 0536-8462066; E-mail: zhiqingao@ wfmc.edu.cn

*［基金項目］山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2009DM024; No.ZR2011HM043) ;山東省高等學校科技計劃(No.J11LF33) ; 2013年山東省政府公派留學項目;山東省醫(yī)藥衛(wèi)生計劃(No.2014WS0478)

［收稿日期］2014-10-21

［文章編號］1000-4718(2015)06-1125-05

［中圖分類號］R574.4

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.028