孫盈乾，張憲省，董海洲，侯漢學(xué)，張錦麗

(1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271000;2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山東泰安 271000)

生物活性物質(zhì)能降低一些慢性疾病發(fā)生率，并且有抗氧化活性。因此對(duì)果蔬、農(nóng)業(yè)工業(yè)廢渣中具有生物活性的酚類化合物的研究越來越深入。酚類結(jié)構(gòu)可以減緩或阻止氧化反應(yīng)的進(jìn)行［1］。由于彩色小麥麩皮中的酚酸大多數(shù)與纖維素木糖以酯鍵或醚鍵的形式相連［2］，以結(jié)合態(tài)形式存在，可被酸堿或微生物分解［3-5］。I-Hsin Lee［6］等研究了絲狀真菌發(fā)酵黑豆，發(fā)酵黑豆的DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力均有所提高。Ming-Yen Juan［7］等選用枯草桿菌BCRC14715固態(tài)發(fā)酵黑豆，結(jié)果表明發(fā)酵提高了總酚和花青素含量、DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力。K.Katina［8］等研究了酵母菌、乳酸菌及混合發(fā)酵對(duì)天然黑麥及發(fā)芽黑麥營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響，研究結(jié)果表明，發(fā)芽后用啤酒酵母發(fā)酵能顯著提高游離酚酸的含量。

目前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究已顯示出固態(tài)發(fā)酵小麥麩皮、秸稈、豆類等能提高抗氧化性能。為提高彩麥麩皮的抗氧化能力，本文采用已從麩皮中中分離出菌種，用固態(tài)發(fā)酵的方法提高紫麥麩皮中的游離酚類物質(zhì)含量，以期找到能有效降解與多糖和木質(zhì)素相連的酯鍵或醚鍵，釋放出游離的酚類物質(zhì)的菌種，為微生物發(fā)酵麩皮及其在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

由肥城富士康面粉廠不同來源的麩皮中篩選出的霉菌13 株。其中Ⅰ:取自放置于陰暗屋內(nèi)尼龍袋中已發(fā)生自然霉變的麩皮;Ⅱ:取自背陰處墻角，有泥土處，散落的濕潤(rùn)的麩皮;Ⅲ:取自水泥地路面處，自然堆積的麩皮;紫色小麥:濟(jì)南民天面粉有限公司。

1.1.2 試劑

木糖、三氯化鐵、地衣酚、DPPH、無水碳酸鈉、沒食子酸、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇均為分析純。RP-HPLC 所用試劑為色譜純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

M2e 多功能微孔板檢測(cè)儀 (USA，Molecular Devices);SHB 型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);DLSB-5 型低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);R-1001 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);高效液相色譜儀(LC-20AT 高壓泵)，日本島津公司，島津色譜柱Inertsil ODS-SP (250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.3 試驗(yàn)方法

紫色小麥麩皮:紫色小麥→脫皮→粉碎→過篩(40 目)→滅菌(100℃，15min)。

1.3.1 麩皮的固態(tài)發(fā)酵

從斜面保藏培養(yǎng)基上挑取幾環(huán)孢子于無菌水中，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為106個(gè)/mL。稱取適量麩皮，加入菌浮液于適宜溫度下發(fā)酵。發(fā)酵后的紫麥麩皮樣品于50℃烘箱中干燥，磨碎。

1.3.2 總酚及酚酸的提取及測(cè)定

(1)總酚及酚酸的提取

總酚的提取。用80%的甲醇提取發(fā)酵后的紫麥麩皮，超聲輔助提取1h，離心。重復(fù)提取1 次。合并上清液，濃縮至無醇，用甲醇定容至10mL。

酚酸的提取。發(fā)酵后的紫麥麩皮中加入正己烷，超聲輔助脫脂1h，離心。重復(fù)脫脂1 次，用甲醇提取脫脂后的紫麥麩皮，合并上清液，濃縮至無醇，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 為2，用等體積乙醚/乙酸乙酯萃取3 次，合并有機(jī)相于40 ℃濃縮干燥，色譜甲醇復(fù)溶后得游離型酚酸。

(2)總酚含量的測(cè)定

100μL 總酚溶液中加入6mL 蒸餾水，渦旋震蕩5s，靜置1～8min;加入1.5mL Na2CO3溶液，加蒸餾水定容到10mL。室溫避光條件下，將密封的試管靜置2h;765nm 下測(cè)定吸光度。以空白試劑做參比，沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)確定回歸方程為y=0.116 8x－0.005 32，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 5，其中x:沒食子酸濃度(μg/mL)。

(3)DPPH·清除率

取總酚溶液0.1mL 加3.9mL 6×10－5mol/L DPPH 溶液，室溫黑暗下反應(yīng)60min。然后在517nm 處，測(cè)定0和60min 時(shí)的吸光度。

(4)酚酸組成

色譜條件:流動(dòng)相為A—水/冰醋酸(0.5%，v/v);B—乙腈/冰醋酸(0.5%，v/v)。梯度洗脫為0～20 min，B 為10% ;20～30 min，B 為10%～50% ;30～40 min，B為50%～100% ;40～45min，B 為100%～10%。進(jìn)樣量為20μL;進(jìn)樣前酚酸溶液均用0.45μm 微孔濾膜過濾。定性定量方法為保留時(shí)間和最大吸收波長(zhǎng)定性，外標(biāo)法定量。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的RP-HPLC 譜圖(280 nm)

將酚酸標(biāo)準(zhǔn)品按一定濃度溶于乙腈中，制得11 種標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)樣，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，確定其保留時(shí)間及分離效果。所得標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖如圖1 所示。將11 種標(biāo)準(zhǔn)品按一定倍數(shù)稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)列于表1 中。

表1 11 種標(biāo)準(zhǔn)樣品的相關(guān)性系數(shù)

1.3.3 水溶性阿拉伯木聚糖的測(cè)定

取100mg 發(fā)酵后的紫麥麩皮，加入10mL 水，30℃振蕩2h，離心;取1mL 上清液，加入1mL 4 mol/L 的HCl，在密封的試管內(nèi)100℃保持2h，冷卻;取1 mL 加入到試管，加入2mL 水，3mL FeCl3和0.3mL 地衣酚;沸水浴加熱30min，取出后加入蒸餾水到10mL，冷卻;670 nm 下測(cè)吸光度。以空白試劑做參比，木糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)確定回歸方程為y=0.54x－0.002，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，其中x:木糖濃度(mg/mL)。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(ANOVA)和Duncan 多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(α＜0.05)，所有測(cè)定重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的總酚含量

Ⅱ-M1 對(duì)總酚含量的釋放效果較好(圖2)。由樣本Ⅱ篩選出的霉菌發(fā)酵紫麥麩皮后的總酚含量沒有顯著性差異。樣本Ⅰ篩選出的霉菌發(fā)酵紫麥麩皮后的總酚含量差異顯著。

霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后的總酚含量增加，這一結(jié)果與Dordevic 等［9］、JEFFREYMOORE 等［10］的研究結(jié)果一致。紫色小麥麩皮中加入霉菌的菌懸液固態(tài)發(fā)酵，可以斷裂與酯類連接的酯鍵或醚鍵，使酚類物質(zhì)由結(jié)合型變?yōu)橛坞x型，含量增加。麩皮中加入霉菌，在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性的酶類，使麩皮的細(xì)胞壁發(fā)生降解，釋放出更多的酚類化合物。

圖2 霉菌發(fā)酵對(duì)紫麥麩皮總酚含量的影響

2.2 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的DPPH·清除率

由圖3 可以看出，Ⅱ-M1、Ⅲ-M6 固態(tài)發(fā)酵紫色小麥麩皮后的DPPH·清除率的增加較為顯著。Ⅱ、Ⅲ來源篩選出的霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后的DPPH·清除率差異顯著。

圖3 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的DPPH·清除率

霉菌固態(tài)發(fā)酵紫色小麥麩皮后的DPPH·清除率均有一定程度的提高，霉菌最高增加了0.33 倍。紫麥麩皮中總酚含量與DPPH·清除率增加程度并不是一致的。DPPH·清除率大小可能是多種生物活性成分協(xié)同作用的結(jié)果，在發(fā)酵過程中，微生物作用于麩皮中，除了釋放出游離的酚酸外、還釋放出了類黃酮、木酚素等化合物，用FC 法測(cè)定出的是酚類化合物的含量，而DPPH·的清除并不是這些酚類化合物作用簡(jiǎn)單加和的結(jié)果。研究表明，酚酸［11］和類黃酮［12］有一定的清除自由基的效果。

2.3 霉菌發(fā)酵紫麥的酚酸組成

由表1 可以看出，霉菌發(fā)酵紫麥麩皮后，麩皮中游離型酚酸以阿魏酸為主。異阿魏酸和水楊酸的含量次之，原兒茶酸和丁香酸均可檢測(cè)到，但是含量相對(duì)較低。部分菌株發(fā)酵后，沒有檢測(cè)到?jīng)]食子酸和對(duì)羥基苯甲酸。其中第Ⅱ-M1、Ⅲ-M5 株菌發(fā)酵后釋放出的酚酸含量相對(duì)較高，達(dá)到了2 600μg/g 麩皮以上。

固態(tài)發(fā)酵后釋放出的酚酸以阿魏酸為主約占酚酸總量的50%～91%，其次主要是對(duì)香豆酸、異阿魏酸，這說明固態(tài)發(fā)酵對(duì)羥基肉桂酸的衍生物的釋放效果較好。總的來說，肉桂酸類酚酸的含量高于苯甲酸類的酚酸。與丁巖［13］關(guān)于紫麥麩皮游離中酚酸組成的研究結(jié)果相比，發(fā)酵后阿魏酸的含量顯著提高，檢測(cè)到?jīng)]食子酸、異阿魏酸和水楊酸。

表2 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的游離酚酸組成(μg/g 脫脂麩皮)

2.4 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

由圖4 可以看出，霉菌發(fā)酵后可溶性阿拉伯木聚糖提取率一定程度的降低，這可能是因?yàn)槊咕诠虘B(tài)發(fā)酵過程中，能夠較大程度的以阿拉伯木聚糖作為碳源生長(zhǎng)。

麩皮發(fā)酵過程中內(nèi)部結(jié)構(gòu)變的疏松，易于水溶性阿拉伯木聚糖的溶出。阿拉伯木聚糖與羥基肉桂酸等通過酯鍵、醚鍵形成酯類、醚類，在發(fā)酵過程中，酯鍵、醚鍵斷裂，酚酸和可溶性阿拉伯木聚糖被釋放，微生物維持自身生長(zhǎng)的需要，可利用的營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)基本消耗殆盡時(shí)，利用了一部分釋放出的可溶性阿拉伯木聚糖，使發(fā)酵后總酚含量高的菌株，可溶性阿拉伯木聚糖含量反而相對(duì)較低。

3 結(jié)論

圖4 霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

適宜條件下固態(tài)發(fā)酵彩麥麩皮是提高游離酚酸含量有效的方法，不同種類菌株的發(fā)酵效果各不相同。選用適當(dāng)?shù)木臧l(fā)酵，對(duì)提高酚酸釋放及抗氧化能力有重要的意義。實(shí)驗(yàn)室篩選出的霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后，研究總酚含量、DPPH·清除率、酚酸組成以及可溶性阿拉伯木聚糖含量。不同菌株固態(tài)發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果表明，霉菌的發(fā)酵效果最好，霉菌Ⅳ-11 固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后，具有較好的酚酸釋放及抗氧化能力。霉菌Ⅳ-11 發(fā)酵后總酚含量為3.55mg/g 麩皮，DPPH·清除率為51%，酚酸含量為2 922μg/g 麩皮。

不同來源麩皮篩選出的菌株及同一來源麩皮中篩選出的菌株固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮的結(jié)果呈現(xiàn)出差異性，這體現(xiàn)了不同的微生物群落對(duì)底物的利用有不同的特征。固態(tài)發(fā)酵有利于酚酸的釋放及抗氧化能力的提高，但菌株選擇不恰當(dāng)會(huì)使酚酸含量降低，Jose Antonio Curiel［14］用乳酸菌發(fā)酵食品，酚酸含量降低。固態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)酵菌株的選擇非常重要。

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