劉良國 楊品紅 謝春華 王曉艷 徐黎明

(湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心 動物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 常德 415000)

洞庭青鯽(Dongtingking crucian carp, Carassius auratus var. Dongtingking, 暫命名)是近年來在洞庭湖區(qū)澧水北民湖水域發(fā)現(xiàn)的天然二倍體鯽魚(2N=100)新品系(楊品紅等, 2005a)。因其具有生長速度快、養(yǎng)殖產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、原汁原味等綜合性狀優(yōu)勢, 深受廣大漁農(nóng)和消費(fèi)者青睞, 具有極為廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用前景。在前期的工作中, 作者從形態(tài)特征、染色體組型、生殖方式等方面對洞庭青鯽進(jìn)行了研究(楊品紅等, 2005b, 2007; 吳珊等, 2006), 初步證實(shí)洞庭青鯽是一個(gè)具有兩性繁殖方式、形態(tài)性狀和染色體數(shù)目穩(wěn)定的二倍體(2N=100)鯽魚品系。與已報(bào)道的眾多鯽品系相比較, 洞庭青鯽與 2個(gè)鯽品系性狀較為相似:一是彭澤鯽, 二是普通的野鯽。彭澤鯽原產(chǎn)于江西省彭澤縣丁家湖、芳湖和太白湖等天然水域, 最初江西省水產(chǎn)研究所認(rèn)為彭澤鯽也是二倍體(2N=100)兩性生殖魚類(傅永進(jìn), 1996), 但隨后報(bào)道的彭澤鯽均為染色體數(shù)目在 150條左右的雌核發(fā)育魚(Zhou et al,2002; 劉良國等, 2004)。洞庭青鯽與最初報(bào)道的彭澤鯽一樣, 也是行兩性生殖方式的二倍體鯽魚種群。另外, 作者對洞庭湖區(qū)普通野鯽的染色體組型進(jìn)行研究, 結(jié)果表明在洞庭湖區(qū)同時(shí)存在染色體數(shù)為100和150±而且在形態(tài)上無法區(qū)分的兩種倍性野鯽群體(劉良國等, 2012)。因此, 從洞庭青鯽的來源和染色體倍性上看, 它又與洞庭湖區(qū)的野鯽具有一定的相似性。為了進(jìn)一步了解洞庭青鯽這一新型鯽魚品系的遺傳結(jié)構(gòu)特征, 揭示不同鯽品系之間的遺傳關(guān)系, 有必要從分子生物學(xué)的角度對洞庭青鯽和三個(gè)與之性狀較為相似的彭澤鯽(C. auratus var. Pengze)、野生二倍體和三倍體鯽進(jìn)行比較分析。

ISSR (inter-simple sequence repeat, 單一的序列重復(fù)區(qū)間)分子標(biāo)記是在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Zietikiewicz et al, 1994), 它結(jié)合了SSR和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn), 具有模板需要量少、多態(tài)性豐富、實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡單、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn), 現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于物種的種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系的分析、遺傳多樣性與進(jìn)化等研究領(lǐng)域(Kojima et al,1998; Reddy et al, 2002; Jian et al, 2004; Ai et al,2006)。本實(shí)驗(yàn)采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù), 分析了洞庭青鯽種群與其它鯽品系的分子遺傳多樣性, 對于探討鯽魚乃至脊椎動物多倍體的起源與進(jìn)化機(jī)制具有一定的理論意義, 同時(shí)對二倍體洞庭青鯽種質(zhì)資源的保護(hù)及育種實(shí)踐、養(yǎng)殖發(fā)展也具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用洞庭青鯽(F6)和彭澤鯽取自大湖股份湖南省水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)基地, 所用二倍體和三倍體野鯽采自洞庭湖區(qū)的沅水和澧水水域。在通過腎細(xì)胞染色體活體制片方法, 確定不同鯽品系的染色體倍性后, 每個(gè)鯽品系各取樣 30尾, 分別剪其背部肌肉用95%乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

取1.0g肌肉提取基因組DNA, 參照常規(guī)的酚-氯仿抽提程序進(jìn)行。提取后的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量, 用紫外分光光度計(jì)估算濃度和純度, 調(diào)整濃度至40ng/μL, 4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

采用加拿大British Columbia大學(xué)公布的ISSR引物序列, 由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系為 25μL, 其中 40ng/μL DNA 模板 2.0μL, 10μmol/L ISSR 引物 1.0μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2.5μL, 10× PCR buffer 2.5μL, Taq DNA polymease 1.0μL (1U/μL), ddH2O 16μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)? 95°C 5 min, 接著 95°C 30 s, 52°C 45 s, 72°C 2 min,共45個(gè)循環(huán), 最后72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在4%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳(50 W恒功率2.5 h), ABI PRISM 377測序儀掃描, 得到電泳圖。并以50—1000 bp標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量進(jìn)行對照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用GENESCAN3.1軟件打開由ABI PRISM 377測序儀掃描得到的電泳圖, 對膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取, 得到各片段大小的結(jié)果, 導(dǎo)出結(jié)果并將結(jié)果保存為XLS格式, 對EXCEL表內(nèi)數(shù)值進(jìn)行0/1賦值記帶, 形成由“l(fā)”和“0”組成的原始二元數(shù)據(jù)矩陣。

根據(jù) Apostol等(1996)的假設(shè), 將每個(gè)條帶視為一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)分析, 多態(tài)位點(diǎn)比例(P) = 多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/總位點(diǎn)數(shù)×100%。由Lynch(1990)的方法計(jì)算群體內(nèi)、群體間的遺傳相似指數(shù)和遺傳距離: 兩個(gè)體間的遺傳相似指數(shù)Sxy= 2Nxy/ (Nx+ Ny), 其中Nxy表示個(gè)體x和y之間共有的DNA擴(kuò)增片段數(shù), Nx和Ny分別是個(gè)體x和y的DNA擴(kuò)增片段數(shù)。群體內(nèi)的遺傳相似指數(shù) S為群體內(nèi)所有的兩個(gè)體間遺傳相似指數(shù)的平均值, 群體內(nèi)的遺傳距離D = 1－S; 群體間的遺傳相似指數(shù)Sij為群體i和群體j中所有隨機(jī)配對的兩個(gè)體間遺傳相似指數(shù)的平均值, 群體間的遺傳距離Dij= 1–Sij。

1.5 聚類分析

根據(jù)各樣本之間的遺傳距離, 用MEGA4軟件包中的UPGMA (unweighted pair-group methods with arithmetic means)方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

從96個(gè)ISSR引物中, 篩選出擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、多態(tài)型高、重復(fù)性好的引物9個(gè)。9個(gè)引物在四個(gè)鯽品系群體中共檢測到 1637個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn), 片段大小在75—1000 bp之間, 每個(gè)引物檢測出的位點(diǎn)數(shù) 141—232個(gè)不等(圖1)。在1637個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中, 多態(tài)位點(diǎn)數(shù) 1572個(gè), 多態(tài)位點(diǎn)比例 96.03%, 不同引物擴(kuò)增出的多態(tài)位點(diǎn)比例均在 90%以上(表 1), 表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。

2.2 群體內(nèi)的遺傳多樣性

對四個(gè)鯽品系群體內(nèi)的擴(kuò)增條帶(位點(diǎn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 得到四個(gè)鯽品系群體的多態(tài)位點(diǎn)比例和遺傳距離(表 2)。從多態(tài)位點(diǎn)比例和遺傳距離數(shù)據(jù)指標(biāo)來看, 洞庭青鯽群體明顯低于二倍體鯽和三倍體鯽兩個(gè)群體(P＜0.05), 而與彭澤鯽群體的差異不顯著(P＞0.05)。表明洞庭青鯽、彭澤鯽等選育養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性明顯低于野生鯽群體。而在野生鯽群體中,又以三倍體鯽群體的遺傳多樣性最高。

2.3 群體間的遺傳相似系數(shù)與遺傳距離

四個(gè)鯽品系群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離見表 3。計(jì)算結(jié)果表明, 四個(gè)群體之間的平均遺傳相似系數(shù)在 0.8622—0.8809, 平均遺傳距離為 0.1191—0.1378。其中洞庭青鯽與彭澤鯽的遺傳相似系數(shù)最高(0.8809), 遺傳距離最小(0.1191); 而二者與三倍體鯽的遺傳相似系數(shù)最小(均為0.8622), 遺傳距離最遠(yuǎn)(均為 0.1378)。

圖1 引物(GA)8YT和(CTTCA)3對四個(gè)鯽品系群體的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.1 The ISSR amplified results for the population of 4 strains of crucian carp by the primer (AG)8YT and (CTTCA)3 M. ROX1000 Ladder marker; 1—7. 洞庭青鯽; 8—14. 二倍體野鯽; 15—21. 三倍體野鯽; 22—28. 彭澤鯽

2.4 聚類分析

根據(jù)四個(gè)鯽品系群體間的遺傳距離數(shù)據(jù), 采用MEGA 4軟件包中的 UPGMA方法進(jìn)行聚類分析,得到四個(gè)鯽品系群體的 UPGMA分支樹狀圖(圖 2),結(jié)果為洞庭青鯽與彭澤鯽聚成一個(gè)分支, 二倍體鯽與三倍體鯽聚成一個(gè)分支, 然后兩個(gè)分支再聚合在一起。

3 討論

3.1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在不同鯽品系遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

采用ISSR分子標(biāo)記對種群遺傳多樣性進(jìn)行分析時(shí), 由于 ISSR引物可以與整個(gè)基因組內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行雜交, 因此可以獲得大量的遺傳信息, 在同一物種內(nèi)的不同品系或群體的遺傳多樣性研究中, 是一種非常有效的手段(Kol et al, 2007)。鯽(C. auratus)是一Liu等(2009)、高麗霞等(2011)用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光檢測淇河鯽、野鯽和紅鯽的ISSR研究結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在對不同鯽品系群體進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí), 采用 ISSR技術(shù)比 RAPD技術(shù)更為高效,更能揭示它們之間的遺傳差異, 這與兩種標(biāo)記的檢測位點(diǎn)不同有關(guān), RAPD標(biāo)記是對生物基因組的隨機(jī)個(gè)分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、多樣性高、遺傳背景復(fù)雜的類群(肖俊等, 2010), 采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對不同鯽種群的遺傳多樣性研究已有報(bào)道: 如 Liu等(2009)利用12個(gè)ISSR引物對異源四倍體鯽鯉及其原始親本紅鯽和鯉魚群體進(jìn)行分析, 高麗霞等(2011)用 8個(gè)ISSR引物對淇河鯽和兩個(gè)野生鯽魚群體進(jìn)行擴(kuò)增,均檢測出非常豐富的遺傳多樣性。

表1 ISSR引物在四個(gè)鯽品系群體中檢測的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)比例Tab.1 Number of polymorphic loci and the percentage in the population of the 4 strains of crucian carp with a single primer by ISSR analysis

表2 四個(gè)鯽品系群體內(nèi)的遺傳多樣性Tab.2 The genetic diversities within the population of 4 strains of crucian carp

表3 四個(gè)鯽品系群體間的遺傳相似系數(shù)(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Tab.3 The genetic similarities (above diagonal) and genetic distances (below diagonal) among the 4 strains of crucian carp

圖2 四個(gè)鯽品系群體的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram for the 4 strains of crucian carp

本實(shí)驗(yàn)采用9個(gè)ISSR引物對四個(gè)鯽品系群體進(jìn)行擴(kuò)增, 在四個(gè)鯽品系群體中, 平均每個(gè) ISSR引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為182, 多態(tài)位點(diǎn)為175。9個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出 1637個(gè)條帶, 其中單態(tài)位點(diǎn)只有 65個(gè),其余1572個(gè)為多態(tài)位點(diǎn), 多態(tài)位點(diǎn)比例高達(dá)96.03%,高于Zhou等(2000)用RAPD技術(shù)研究銀鯽、劉良國等(2008)用 RAPD 技術(shù)研究彭澤鯽的結(jié)果, 也高于選擇擴(kuò)增, 而 ISSR標(biāo)記是檢測基因組內(nèi)廣泛存在的微衛(wèi)星DNA片段和間隔區(qū)DNA (Mattioni et al, 2002);同時(shí), 擴(kuò)增片段的不同電泳檢測方法也直接影響到遺傳多樣性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)的 ISSR擴(kuò)增片段是在 4%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后, 再采用 ABI PRISM 377自動測序儀對膠圖上的條帶進(jìn)行掃描檢測(可以檢測出兩個(gè)堿基差異大小的片段), 與瓊脂糖凝膠電泳和普通的紫外光電泳檢測相比, 檢測出的基因片段數(shù)目更多、多態(tài)性更為豐富。綜上所述, 采用本實(shí)驗(yàn)方法, 能夠更加高效地對同為一個(gè)物種的不同鯽品系群體遺傳多樣性進(jìn)行檢測。

3.2 不同鯽品系群體的遺傳關(guān)系和資源保護(hù)

洞庭青鯽是從天然水域中選育的二倍體鯽魚新品系, 經(jīng)過連續(xù)7代的人工選育, 其遺傳性狀已趨于穩(wěn)定。從表2可見, 在四個(gè)鯽品系群體中, 洞庭青鯽群體內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)比例、遺傳距離值均為最低, 說明了其遺傳性狀的相對穩(wěn)定。彭澤鯽也是人工養(yǎng)殖的群體, 其種群內(nèi)的遺傳多樣性只略高于洞庭青鯽, 這可能與其在雌核生殖的過程中, 彭澤鯽卵子接受了少量異源精子基因有關(guān)。與洞庭青鯽、彭澤鯽品系相比,野生鯽品系的遺傳多樣性明顯偏高, 其中三倍體鯽的遺傳多樣性又高于二倍體鯽, 這可能與野生鯽品系采自洞庭湖水系天然水體, 不同個(gè)體或物種之間存在基因交流有關(guān)。筆者曾經(jīng)對洞庭湖水系兩種不同倍性野鯽的數(shù)量和生殖方式進(jìn)行研究(劉良國等,2012), 發(fā)現(xiàn)二倍體鯽所占比例(15%)遠(yuǎn)小于三倍體鯽(85%), 認(rèn)為三倍體鯽是一種行雌核發(fā)育生殖方式的鯽, 其卵子無論是與同源還是異源精子結(jié)合, 都能產(chǎn)生正常的三倍體鯽后代; 而二倍體鯽是行兩性生殖方式的鯽, 其卵子只有與二倍體鯽的精子結(jié)合, 才能產(chǎn)生正常的二倍體后代。由于三倍體鯽在生殖過程中存在異精雌核發(fā)育的現(xiàn)象, 因此, 本實(shí)驗(yàn)檢測出三倍體鯽的遺傳多樣性高于二倍體鯽。

Thorp(1982)的研究認(rèn)為, 不同物種間的遺傳相似系數(shù)I = 0.2—0.8 (遺傳距離D = 0.2—0.8), 同科屬群體間I = 0.1—0.5 (D = 0.5—0.9), 同種群體間I =0.8—0.97 (D = 0.03—0.2)。本實(shí)驗(yàn)研究表明, 四個(gè)鯽品系群體之間的遺傳相似系數(shù)在0.8622—0.8809 (遺傳距離為 0.1191—0.1378), 符合同種群體間的遺傳相似系數(shù)范圍, 說明四個(gè)鯽品系仍然屬于同一個(gè)物種C. auratus。四個(gè)鯽品系群體間的遺傳距離和聚類分析表明, 洞庭青鯽和彭澤鯽之間、二倍體鯽和三倍體鯽之間的親緣關(guān)系較近, 而洞庭青鯽、彭澤鯽與二倍體鯽、三倍體鯽的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。洞庭青鯽與彭澤鯽均起源于天然水域的二倍體鯽, 因其都具有優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)生長性狀而被多代人工選育, 因而在遺傳性狀上二者可能也具有較大的相似性, 表現(xiàn)出親緣關(guān)系較近; 野生二倍體和三倍體鯽生活于相同的水體, 二者在形態(tài)上很難區(qū)分, 據(jù)劉良國等(2012)報(bào)道, 三倍體鯽的來源可能是由于二倍體鯽因環(huán)境因素(如溫度的劇變等)產(chǎn)生二倍體的卵子, 這些二倍體卵子再與正常的單倍體精子雜交形成, 本實(shí)驗(yàn)得出二者親緣關(guān)系較近與之相符。有報(bào)道表明(沈俊寶等,1983; 王蕊芳等, 1988), 由于環(huán)境急變或天然雜交等原因, 二倍體鯽可以特化成三倍體鯽, 由于三倍體鯽行雌核發(fā)育, 具有較強(qiáng)的繁殖力和適應(yīng)性, 因而種群上具有較強(qiáng)的優(yōu)勢, 這可能就是天然水域中三倍體鯽的比例遠(yuǎn)大于二倍體鯽的原因。最初發(fā)現(xiàn)的二倍體彭澤鯽現(xiàn)在都是行雌核發(fā)育的三倍體, 也可能與上述原因有關(guān)。據(jù)此推測, 二倍體洞庭青鯽一旦遭遇急劇的環(huán)境變化, 其中部分個(gè)體也有可能特化為行雌核發(fā)育生殖方式的三倍體, 進(jìn)一步通過人工選育, 就有可能導(dǎo)致新的三倍體洞庭青鯽種群的形成和二倍體洞庭青鯽種群的消失。因此, 自然界中, 二倍體洞庭青鯽和二倍體野生鯽的存在就顯得尤為珍貴, 對二倍體鯽種質(zhì)資源的保護(hù)必須引起重視。

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