張 鑫 蔡秀紅 黃貽濤 張子平 王國棟 鄒志華 王淑紅 王藝磊

(集美大學水產(chǎn)學院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室 廈門 361021)

雜色鮑(Haliotis diversicolor)是一種海生軟體動物, 我國于20世紀70年代培育出雜色鮑苗, 并成功進行了人工養(yǎng)殖。如今, 雜色鮑已成為我國東南沿海最重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖鮑類之一(蘇天鳳, 2006)。然而, 隨著溫室效應(yīng)的不斷加劇, 使得一些海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)的溫度也隨之升高(P?rtner, 2001)。而高溫又必然會伴隨著水中氧濃度的降低(P?rtner, 2001; Huey et al,2005)。這些因素都會對雜色鮑的生存環(huán)境產(chǎn)生很大的影響, 并且導致雜色鮑的大量死亡(周晶等, 2006)。

硒結(jié)合蛋白1(selenium-binding protein 1, SBP1)是一類不含硒半胱氨酸并且在生物體內(nèi)普遍存在且高度保守的含硒蛋白。按照分子量的不同可以分為兩類——14 kDa SBP和54 kDa SBP。14 kDa SBP作為脂肪酸結(jié)合蛋白首先是在鼠的肝臟中被發(fā)現(xiàn)的(Bansal et al, 1989)。54 kDa SBP則是在線蟲、植物和哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的蛋白(Bansal et al, 1989;Bevan et al, 1998)。研究表明, 氧化應(yīng)激可以誘導SBP的表達(Hassan et al, 1983)。此外, SBP還可能參與抑制癌細胞的增長(Morrison et al, 1988; Yang et al,1998)、還原/氧化反應(yīng)的調(diào)控(Yang et al, 1998)、解毒(Ishii et al, 1996)和高爾基體蛋白轉(zhuǎn)運(Porat et al,2000)等過程。在軟體動物中, SBP1僅在櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和皺紋盤鮑(H. discus hannai)中有相關(guān)報道。Song等(2006)的研究表明, 櫛孔扇貝在被微生物感染以及 H2O2的氧化應(yīng)激處理之后, SBP的表達量逐漸上升。Zhang等(2011)通過研究發(fā)現(xiàn): 當皺紋盤鮑每天攝入足夠的硒、鐵和鋅時可以使 SBP的mRNA表達量增加。目前尚未有SBP1參與雜色鮑免疫調(diào)控的相關(guān)報道, 本研究將可為此提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

1.1.1 實驗動物 從宏運鮑魚場(福建漳浦)購買雜色鮑健康個體, 體長(6.20±0.50)cm, 體質(zhì)量(18.70 ± 2.50)g, 分批暫養(yǎng)于本實驗室(25±1.50)°C的海水循環(huán)系統(tǒng)中, 每日晚間投喂海帶1次, 暫養(yǎng)10 d后用于實驗。

1.1.2 試劑與工具酶 總RNA提取試劑RDP由本實驗室自行配制, 逆轉(zhuǎn)錄所用的逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)以及熒光定量實驗所用的SYBR Green Master Mix均購自Promega公司, GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于捷瑞生物公司(上海), 連接所用的pMD19-T試劑盒購自寶生物(大連)公司。大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞和副溶血弧菌菌種均為本實驗室保種。

1.1.3 引物 根據(jù)本課題組已發(fā)表的文章中所用的通用引物(張鑫等, 2014), 以及從本實驗室已有的雜色鮑轉(zhuǎn)錄組EST數(shù)據(jù)庫(依托上海眾信生物技術(shù)有限公司完成)中獲得的 SBP1基因的部分序列, 利用Primer軟件設(shè)計出特異性的RACE引物來獲得全長。之后, 再根據(jù)完整的HdSBP1的cDNA 序列設(shè)計熒光定量PCR引物以及head to toe驗證引物, 以上所有引物均是由捷瑞生物工程有限公司(上海)合成的。主要的引物序列列于表1。

表1 主要的引物序列信息Tab.1 Sequence information of the primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 雜色鮑高溫應(yīng)激實驗、缺氧誘導實驗、副溶血弧菌感染實驗以及高溫和缺氧聯(lián)合應(yīng)激實驗 參照本課題組已發(fā)表的文章(張鑫等, 2014)中的實驗方法, 實驗組與對照組的雜色鮑均各取8只, 分別取血淋巴和鰓組織, 將離心后得到的血細胞保存于–80°C超低溫冰箱; 鰓組織部分保存于 RNAlater中,部分保存于液氮中, 用于RNA的提取。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 雜色鮑鰓組織和血細胞的總RNA的提取根據(jù)本實驗室自制的RDP試劑的常規(guī)使用方法進行(王藝磊等, 2003)?？俁NA的完整性利用 2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,同時使用微量分光光度計測定 A260/A280的值以及RNA的濃度。cDNA的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的具體說明嚴格操作。

1.2.3 HdSBP1基因 cDNA全長的克隆 利用Primer 5.0軟件, 根據(jù)從本實驗室的雜色鮑轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的EST序列中篩選出的HdSBP1基因片段,設(shè)計特異引物。使用SMART-RACE的方法擴增得到基因的全長 cDNA序列, 并用 head to toe引物對其ORF (open reading frame)的準確性進行驗證。引物列于表1。

1.2.4 HdSBP1的生物信息學分析 分別使用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的不同工具對測序結(jié)果進行驗證、拼接以及開放閱讀框的確定。HdSBP1蛋白的等電點及分子量則是使用 ExPASy(http://web.expasy.org/compute_pi/)進行預測。序列中可能存在的信號肽序列通過 SingalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行查詢。潛在的糖基化位點和磷酸化位點分別使用 NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)以及NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行預測。通過 The PSIPRED Protein Sequence Analysis Workbench (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測, 同時利用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive)對HdSBP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測。序列的多重比對通過BioEdit軟件進行, 隨后使用MEGA5.05軟件完成系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.2.5 HdSBP1基因在雜色鮑各組織及不同應(yīng)激條件下的表達 實時熒光定量PCR使用的cDNA模板以隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成, 選用β-actin作為內(nèi)參基因(張鑫等, 2014)。qRT-PCR 采用 20μL 的反應(yīng)體系:10μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix(購自Promega公司), 10μmol/L 的 HdSBP1RT-F Primer和HdSBP1RT-R Primer(表 1)各 0.5μL, cDNA 模板 9μL。具體反應(yīng)條件如下: 95°C 1 min, 95°C 15 s, 60°C 1 min,45個循環(huán)。每個時相分別取5個樣品進行分析, 并根據(jù)儀器分析得出的Ct值計算RQ值即2–ΔΔCt, 隨后利用SPSS 20.0和Microsoft office 2010軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析與作圖, 顯著性差異表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 HdSBP1基因的克隆及序列分析

雜色鮑cDNA全長序列為2269 bp (GenBank登錄號: KJ459335), 包括 5’UTR 113 bp, 3’UTR 662 bp和1494 bp的ORF, 可編碼497個氨基酸。推測蛋白的分子質(zhì)量為55.69 kDa, 等電點為5.53。SignaIP在線分析的結(jié)果表明, HdSBP1基因中不含有信號肽序列。另外, 7個蘇氨酸磷酸化位點、11個絲氨酸磷酸化位點、7個酪氨酸磷酸化位點以及1個糖基化位點也分別包含在該序列之中(圖 1)。在 HdSBP1的氨基酸序列的 N端還包含著一個典型的還原信號基序105CSSC108(CXXC, X代表任意氨基酸殘基)和一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)螯合信號基序(95DELHIJ99)。同樣, 一些 CXXC的衍生序列(30TSECC34,123CINS126,166CLGS169,293CALS296和38lCKGG384)也包含其中(Chivers et al, 1997; Fomenko et al, 2003)。另外, 在HdSBP1的氨基酸序列還包含著多個金屬位點的結(jié)合序列(162HTTH165,354HGD356,171HIM173,220HNVM223,250HSIHVWDWTTH260和448MFLM451)(She et al, 2003; Urvoas et al, 2003)。

2.2 HdSBP1空間結(jié)構(gòu)模擬

通過PSIPRED v3.3對HdSBP1的二級結(jié)構(gòu)進行預測, 結(jié)果顯示, 該蛋白共含有 3個α-螺旋和 32個β-折疊。此外, 利用 SWISS-MODEL在線軟件將推導的 HdSBP1蛋白序列與軟件數(shù)據(jù)庫中已有的 PDB code: 2eceA模板進行人工配聯(lián), 并最終構(gòu)建HdSBP1蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)模型(圖2)。

2.3 同源性分析以及對 HdSBP1蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

使用BioEdit軟件將已推導的HdSBP1的氨基酸序列和其它物種的SBP1的氨基酸序列一起進行多重比較(圖3)。比較分析的結(jié)果表明, 不同物種的SBP1氨基酸序列具有很高的保守型, 并且HdSBP1與櫛孔扇貝、人(Homo sapiens)、斑馬魚(Danio rerio)、果蠅(Drosophila melanogaster)和線蟲(Caenorhabdi elegans)的 SBP1氨基酸序列的一致性分別為 62%、62%、67%、53%和 49%, 其中與皺紋盤鮑的一致性最高, 達到了93%。

根據(jù)NCBI上已有的SBP1的氨基酸序列, 利用MEGA5.05軟件, 以鄰位相連法構(gòu)建了 15 種生物的系統(tǒng)進化樹(圖 4)。分析表明, 脊椎動物和無脊椎動物分別聚在兩個大支, 在無脊椎動物里, 雜色鮑與軟體動物皺紋盤鮑和櫛孔扇貝聚為一支。

2.4 雜色鮑HdSBP1基因在不同組織器官中的表達

以雜色鮑的7種不同組織作為檢測對象, 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖5), HdSBP1基因在各組織中均有表達, 并且在鰓和腎中的表達量顯著性高于肝胰腺、肌肉、消化道、粘液腺和血細胞中的表達量(P＜0.05)。

2.5 HdSBP1基因在缺氧誘導、高溫應(yīng)激、高溫缺氧聯(lián)合應(yīng)激以及弧菌感染后的表達

通過 qRT-PCR對經(jīng)過不同外界刺激后 HdSBP1基因在雜色鮑鰓組織中的表達情況進行分析, 結(jié)果顯示: 缺氧誘導處理之后, 實驗組HdSBP1的表達量在處理24 h時顯著性高于對照組(P＜0.05), 而在4 h、96 h和192 h時, 實驗組的表達量和對照組相比無顯著差異(圖 6a); 高溫應(yīng)激之后, 實驗組 HdSBP1基因的表達量在第 1 時相(28°C)和第 3 時相(31°C, 4 h)顯著高于對照組(P＜0.05), 其它各時相實驗組與對照組無顯著差別(圖6b)。缺氧和高溫聯(lián)合應(yīng)激之后, 實驗組 HdSBP1的表達量在 192 h時顯著性高于對照組(P＜0.05), 而在其它各時相實驗組的表達量和對照組相比無顯著性差異(圖6c); 副溶血弧菌注射感染之后,在6 h和24 h時, 實驗組的表達量顯著性高于對照組(P＜0.05), 而在3 h和12 h時實驗組和對照組的表達量并未表現(xiàn)出顯著性的差異(圖6d)。

在經(jīng)過缺氧應(yīng)激的雜色鮑血細胞中, 實驗組HdSBP1的表達量在192 h時顯著高于對照組(P＜0.05),而在其它時相實驗組和對照組的表達量無顯著差異(圖7a); 高溫應(yīng)激后, 實驗組HdSBP1的表達量在第3時相時顯著性高于對照組(P＜0.05), 其它各時相均沒有顯著性變化(圖 7b); 缺氧和高溫聯(lián)合應(yīng)激后, 實驗組HdSBP1的表達量在0 h、4 h和24 h時顯著性高于對照組(P＜0.05), 而在96 h和192 h時, 實驗組的表達量和對照組相比并無顯著差異(圖7c); 副溶血弧菌注射感染之后, 實驗組的HdSBP1基因在每個時相的表達量都顯著性地高于對照組(P＜0.05)(圖7d)。

3 討論

圖1 雜色鮑HdSBP1基因cDNA及其推導的氨基酸序列Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequence of HdSBP1 gene from H. diversicolor

硒結(jié)合蛋白 1是一種高度保守的蛋白(Bansal et al, 1989; Bevan et al, 1998)。它廣泛參與抑制癌細胞的增長(Morrison et al, 1988; Yang et al, 1998)、氧化/還原反應(yīng)的調(diào)控(Yang et al, 1998)、解毒(Ishii et al,1996)以及高爾基體蛋白的轉(zhuǎn)運(Porat et al, 2000)等過程中。本實驗首次成功克隆了雜色鮑 HdSBP-1基因的全序列, 共編碼497個氨基酸, 二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)以β-折疊為主, 僅含有少數(shù)α-螺旋。多重比對結(jié)果表明, 不同物種中的SBP-1具有很高的相似性。而雜色鮑SBP-1蛋白與同為軟體動物的皺紋盤鮑的SBP-1蛋白的一致性達到了93%, 與斑馬魚的一致性也達到了67%。另外, 在HdSBP-1的氨基酸序列中包含有保守的硒結(jié)合蛋白信號基序, 如: CXXC基序、金屬螯合基序和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)螯合信號等等。CXXC基序普遍存在于巰基/二硫鍵氧化還原酶中, 主要負責催化氧化疏基以及還原蛋白質(zhì)異構(gòu)體的二硫鍵(Chivers et al, 1997; Fomenko et al, 2003)。相關(guān)研究已經(jīng)表明 CXXC特征基序?qū)τ谖推渌亟饘匐x子具有很強的結(jié)合特性(Jamba et al, 1997; Liu et al,1997)。同時, 多個保守的金屬結(jié)合位點(如HXXH和HXD等)也包含在HdSBP-1的氨基酸序列中, 這些位點都有可能參與到了對硒離子以及其它重金屬離子的結(jié)合的過程中(She et al, 2003; Urvoas et al, 2003)。此外, 在 HdSBP-1的氨基酸序列中還包含有一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)螯合信號基序, 這也表明 HdSBP-1可能參與細胞膜的流動運輸以及高爾基體轉(zhuǎn)運蛋白的過程(Porat et al, 2000; Teo et al, 2001)。

圖2 HdSBP1的三維空間結(jié)構(gòu)模型Fig.2 The predicted three-dimensional space structure of HdSBP1

圖3 氨基酸序列的多重比對Fig.3 Multiple alignment of the SBP1 amino acid sequence

圖4 HdSBP1系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the SBP1 amino acid sequences between H. diversicolor and other species

圖5 HdSBP1基因在不同組織器官中的表達情況Fig.5 Distribution pattern of HdSBP1 in different tissues of H.diversicolor

圖7 在各種應(yīng)激下HdSBP1基因在雜色鮑血細胞中的表達Fig.7 The change of HdSBP1 expression in haemocytes after various types of stresses

目前SBP1作為一種腫瘤標記物已在人類中得到了廣泛研究, 并且已被證明在多種組織(如: 心、肝、腎和肺)以及細胞系中均有表達(Chang et al, 1997;Yang et al, 1998)。在本實驗中所檢測的雜色鮑各組織中, 同樣均有HdSBP-1基因的表達, 并且在鰓組織中的表達量顯著性地高于其它組織。針對這一結(jié)果, 推測原因可能是由于在較為低等的軟體動物以及甲殼動物中均不含有免疫球蛋白, 而鰓組織作為水生生物的主要呼吸器官, 在免疫系統(tǒng)中就扮演了第一道防線的重要角色。因此, HdSBP-1基因在鰓組織中的高表達, 也間接表明了該基因可能參與到了雜色鮑應(yīng)對外界環(huán)境變化的免疫調(diào)節(jié)機制中。

在軟體動物中, Song等(2006)在研究櫛孔扇貝被微生物感染以及H2O2的氧化應(yīng)激處理之后發(fā)現(xiàn), SBP的表達量逐漸上升。通過實時熒光定量PCR技術(shù), 本實驗報道了在應(yīng)對不同環(huán)境因子的應(yīng)激條件下,HdSBP-1的表達情況。結(jié)果表明, 在缺氧誘導的環(huán)境條件下雜色鮑鰓組織中的HdSBP-1表達在24 h時顯著上調(diào), 隨后表達量雖有所下降但實驗組中的表達量均要高于對照組。在血細胞中, 直到192 h時, 實驗組的表達量才表現(xiàn)出顯著性上調(diào)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的可能原因是鰓組織作為低等水生生物的免疫系統(tǒng)第一道防線, 當環(huán)境中的氧濃度下降時, HdSBP-1在鰓中率先表達, 并由此開啟了機體對外界刺激的免疫調(diào)控機制, 隨后, HdSBP-1在血細胞中的表達也被開啟, 這樣就開啟了整個機體應(yīng)對缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)機制。高溫應(yīng)激下, 無論是在雜色鮑鰓組織還是在血細胞中, HdSBP-1的表達都在應(yīng)激初期表現(xiàn)出顯著性上調(diào), 這一現(xiàn)象表明在高溫初始階段, 機體的免疫調(diào)節(jié)機制被迅速激活, 從而使 HdSBP-1的表達在第 1時相和第 3時相顯著上調(diào)以阻止細胞凋亡。隨著高溫持續(xù)時間的延續(xù), 機體對這一環(huán)境的變化逐漸適應(yīng), 并由此導致HdSBP-1的表達量逐漸回歸到與對照組相當?shù)谋磉_水平。通過對高溫和缺氧實驗結(jié)果的對比, 發(fā)現(xiàn)雜色鮑鰓組織和血細胞中的 HdSBP-1在應(yīng)對高溫引起的環(huán)境壓力方面較缺氧應(yīng)激敏感。為進一步研究這兩種應(yīng)激同時存在時雜色鮑的免疫調(diào)節(jié)機制, 作者進行了高溫和缺氧的聯(lián)合應(yīng)激實驗,結(jié)果表明在鰓組織中, 應(yīng)激 192 h時才檢測到HdSBP-1的顯著性變化, 由此說明, 高溫和缺氧雙重因子的聯(lián)合作用并未使HdSBP-1在雜色鮑鰓組織中的免疫調(diào)節(jié)機能得到更進一步的加強, 而是有可能激活了別的調(diào)節(jié)途徑來共同應(yīng)對更加復雜的外界環(huán)境變化。血細胞中, 在雙重環(huán)境因子的共同作用下, 實驗組HdSBP-1在0 h、4 h和24 h時的表達均顯著高于對照組, 這也表明了HdSBP-1在血細胞中的表達相對鰓組織而言對環(huán)境因子的依賴性更強。此外, 當被副溶血弧菌感染以后, HdSBP-1在血細胞的整個應(yīng)激階段以及鰓組織中的初期和末期也均表現(xiàn)出了顯著上調(diào)的現(xiàn)象, 這一結(jié)果也與對櫛孔扇貝進行的研究結(jié)果存在一定的相似性(鄒慧斌, 2005),同時也表明了HdSBP-1基因參與到了雜色鮑應(yīng)對弧菌感染的免疫應(yīng)答過程中。但是, 在上述不同應(yīng)激條件下HdSBP-1的具體作用機理還不清楚, 仍需進一步深入研究。

總之, 本實驗成功克隆了雜色鮑HdSBP-1的全長cDNA序列。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示, HdSBP-1基因在高溫應(yīng)激、缺氧誘導、高溫和缺氧聯(lián)合應(yīng)激以及副溶血弧菌感染的情況下, 無論是在血細胞還是鰓組織中的表達量均有顯著性變化的發(fā)生。通過本實驗的一些基礎(chǔ)研究, 可以在一定程度上表明該基因作為一種免疫相關(guān)基因, 無論是在應(yīng)對環(huán)境刺激還是病菌感染時都在雜色鮑的免疫應(yīng)答機制中起到了重要的作用。同時, 這些數(shù)據(jù)也可以為今后更進一步揭示雜色鮑在不同應(yīng)激條件下的分子防御機制提供一定的理論依據(jù)。

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