紀(jì)利芹 張明明 王 雷 王寶杰 劉 梅 韓龍江 蔣克勇①

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;2. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 青島 266003)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)自然分布于大西洋東側(cè)沿岸, 是低溫經(jīng)濟(jì)魚類中較名貴的品種。自1992年被引進(jìn)我國(guó)后, 因其生長(zhǎng)速度快、耐低溫、繁殖快、風(fēng)味獨(dú)特兼有豐富的膠原蛋白、市場(chǎng)價(jià)格高等優(yōu)點(diǎn), 已成為我國(guó)北方為數(shù)不多的養(yǎng)殖較為廣泛的經(jīng)濟(jì)品種之一(雷霽霖等, 2005)。

近年來(lái), 隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的加快和人民群眾生活水平的提高, 人們對(duì)水產(chǎn)品的品質(zhì)要求也愈發(fā)趨向鮮活。而水產(chǎn)品的養(yǎng)殖基地與消費(fèi)市場(chǎng)往往相距很遠(yuǎn), 因此尋找鮮活魚運(yùn)輸方法成為研究人員亟待重視和解決的新課題。傳統(tǒng)的有水充氧運(yùn)輸方法成活率低、運(yùn)輸效率低且成本高, 魚貝類易受到損傷而影響口感, 而利用生態(tài)冰溫?zé)o水活運(yùn)技術(shù)運(yùn)輸水產(chǎn)品,不僅縮短了運(yùn)輸時(shí)間、增加了運(yùn)輸密度更有利于產(chǎn)品品質(zhì)的保持(Berka, 1986)。

將需要?；畹乃a(chǎn)品置于水體中降溫至保活運(yùn)輸?shù)臏囟仁菬o(wú)水?；畹氖滓獥l件。當(dāng)溫度降低時(shí), 降溫速率越快, 水產(chǎn)品機(jī)體受到的刺激越強(qiáng)烈, 應(yīng)激反應(yīng)就越大, 從而造成生物個(gè)體的損傷甚至死亡。因此,有效減少降溫過程中引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)也是實(shí)現(xiàn)生態(tài)冰溫?zé)o水活運(yùn)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)(劉小玲, 2007)。由Selye(1956)的應(yīng)激理論可知, 應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致魚體激素和血液代謝水平的變化, 也會(huì)引起分子的表達(dá)的改變(Chen et al, 1995; Weber et al, 2005)。其中, Wap65(warm-temperature-acclimation-associated protein)于1995年由 Kikuchi等(人在鯽魚(Carassius auratus)中首次發(fā)現(xiàn), 主要參與機(jī)體內(nèi)溫度相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng), 在魚類適應(yīng)溫度變化方面發(fā)揮重要作用(Kikuchi et al, 1997)。

本實(shí)驗(yàn)通過研究降溫過程中血液生化指標(biāo)及Wap65-1基因表達(dá)量的變化, 從生理生化和分子生物學(xué)的角度初步揭示了降溫過程中大菱鲆機(jī)體的新陳代謝變化及應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)弱程度, 為大菱鲆和其它水產(chǎn)動(dòng)物的低溫生物學(xué)和無(wú)水?；钐峁├碚撘罁?jù)和數(shù)據(jù)積累。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用大菱鲆(Scophthalmus maximus)購(gòu)買自山東省青島市膠南通用水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng), 暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室控溫循環(huán)水系統(tǒng)中, 暫養(yǎng)期間控制水溫為(18.0 ± 1)°C,溶氧6mg/L以上, pH約為7—8, 鹽度31, 循環(huán)水過濾, 水深維持在 0.9m左右。實(shí)驗(yàn)前2天停止投喂。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

大菱鲆暫養(yǎng) 2天后, 選取規(guī)格一致的成魚 30尾進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 個(gè)體的初始體重為(800.5±10.5)g, 實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每組放養(yǎng)大菱鲆5尾。采用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的降溫循環(huán)水裝置實(shí)現(xiàn)逐步降溫, 所設(shè)大菱鲆的采樣溫度點(diǎn)分別為: 18°C、13°C、8°C、5°C、3°C 和 1°C, 水溫降溫速率設(shè)置為 10°C 以上≤5°C/h;10—1°C≤2°C/h; 1°C 以下≤0.5°C/h。

1.3 樣品采集

實(shí)驗(yàn)開始后在 18°C時(shí)取樣作為起始對(duì)照, 降溫至 13°C、8°C、5°C、3°C 和 1°C 處立刻進(jìn)行取樣, 每個(gè)溫度點(diǎn)處取 5尾平行。取出后立刻放入濃度為200mg/L的 MS-222溶液中做快速深度麻醉, 配制MS-222溶液所用水的溫度與相應(yīng)溫度點(diǎn)的溫度一致,尾靜脈采血, 用1 mL注射器于魚尾柄動(dòng)脈采血5mL以上, 血液不加抗凝劑, 在4°C冰箱靜置5h后, 4°C,12000r/min, 離心 20min制備血清, 血清移入–80°C保存。采血后解剖, 分離出腦、胃、肝臟、頭腎、腎臟、脾臟、肌肉、腸道和心臟等組織液氮中速凍后, 于–80°C低溫保存、待測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及測(cè)定方法

離心后的血清采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定部分生化指標(biāo)(邁瑞 BS-180), 測(cè)定項(xiàng)目包括: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酐(CR)、血糖; 血清皮質(zhì)醇含量利用天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司的試劑盒(CAT#/PID RA1)放免法測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)中克隆和表達(dá)所需的引物均由南京金斯瑞(上海)有限公司合成; RNA提取過程中所需試劑Taq酶、Easytaq buffer、dNTPs及 DNaseⅠ(RNasefree)、RNA 酶抑制劑以及克隆用到的感受態(tài)細(xì)胞 Trans-5a均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。表達(dá)所需要的SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自TaKaRa公司; 普通瓊脂糖膠回收試劑盒, pGM-T載體購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。

1.5 基因片段克隆及表達(dá)引物設(shè)計(jì)

參考與大菱鲆親緣關(guān)系較近的牙鲆(Paralichthys olivaceus)已克隆的 Wap65-1序列全長(zhǎng)(登錄號(hào):GQ396265.1), 利用primer premier軟件設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)過篩選得到一對(duì)特異性引物(Wap65-1 F1, Wap65-1 R1), 見表1, 經(jīng)克隆、測(cè)序得到大菱鲆Wap65-1基因的片段。設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(Wap65-1 F2, Wap65-1 R2), 見表 1, 用于基因的定量表達(dá)分析, 并選取大菱鲆的β-actin 基因作為內(nèi)參, 內(nèi)參引物見表1。

表1 Wap65-1基因片段克隆及表達(dá)引物設(shè)計(jì)Tab.1 Primers used in the cloning and expression of Wap65-1

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及目的基因的定量表達(dá)

對(duì)大菱鲆各組織的 cDNA 進(jìn)行 10倍梯度稀釋,以稀釋后的cDNA為模板進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR, 每個(gè)模板3個(gè)重復(fù)。用Line-Gene K熒光定量PCR儀(Bori, 杭州)檢測(cè), 根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa, 日本)的說(shuō)明書進(jìn)行操作。25μL熒光定量反應(yīng)體系包括: 12.5μL Mix (含 SYBR 染料), 引物各0.5μL (表 1), cDNA 模版 2μL 和 ddH2O 9.5μL。熒光定量之前, 測(cè)定熔解曲線, 檢查引物的特異性。熒光定量PCR反應(yīng)程序如下: 95°C預(yù)變性30s, 35個(gè)循環(huán)(95°C變性 5s, 60°C退火 30s, 72°C延伸 15s), 72°C延伸3min。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果, 以β-actin為內(nèi)參基因, 根據(jù)目的基因以及β-actin的Ct值, 按照樣品中目標(biāo)基因相對(duì)內(nèi)參基因的拷貝比例進(jìn)行分析, 采用2–△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 數(shù)據(jù)處理

血清指標(biāo)數(shù)據(jù)及 Wap65-1基因的表達(dá)量均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包中的單因素方差分析和Duncan氏多重范圍比較進(jìn)行分析, P＜0.05表明差異顯著, 所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆血清生化指標(biāo)的影響

由圖1可知, 大菱鲆血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨溫度的降低總體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì), 在8°C時(shí)活性最高為(14±0.83)U/L, 溫度低于8°C時(shí)活性有所回落但仍顯著高于對(duì)照組。除 13°C實(shí)驗(yàn)組外, 其它實(shí)驗(yàn)組活性都顯著高于初始對(duì)照組(P＞0.05)。

圖1 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響Fig.1 Effects of continuous cooling on activity of serum ALT inS. maximus

由圖2可知, 隨溫度降低肌酐濃度呈升高趨勢(shì),在 13°C 時(shí)濃度最低為(60.67±3.06)μmol/L, 在 3°C時(shí)濃度達(dá)最高值(91±10.15)μmol/L且顯著高于除1°C之外的其它實(shí)驗(yàn)組, 其余各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

由圖3可知, 隨溫度降低, 血清中乳酸脫氫酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 在 13°C時(shí)乳酸脫氫酶活性達(dá)最高值為(19.33±2.65)U/L, 在 3°C 時(shí)降到最低值為(1.33±0.31)U/L, 13—5°C 溫度范圍內(nèi)的酶活顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05), 13—5°C 該溫度范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

由圖4可知, 血糖濃度隨溫度降低, 呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì), 8°C時(shí)濃度最高為(1.15±0.12)mg/g,當(dāng)溫度降到1°C時(shí)回到初始水平, 8—3°C溫度范圍內(nèi)的血糖濃度顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05), 且該溫度范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆血清肌酐濃度的影響Fig.2 Effects of continuous cooling on concentrations of serum creatinine in S. maximus

圖3 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆血清乳酸脫氫酶活性的影響Fig.3 Effects of continuous cooling on activity of serum lactate dehydrogenase in S. maximus

圖4 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆血液葡萄糖濃度的影響Fig.4 Effects of continuous cooling on concentrations of serum glucose in S. maximus

由圖5可知, 血清皮質(zhì)醇含量隨溫度降低呈現(xiàn)升高趨勢(shì), 降到 1°C時(shí)達(dá)到最高值(6.47 ± 0.32)ng/mL,顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。除13°C組外, 其它實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)醇濃度都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖5 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆血清皮質(zhì)醇含量的影響Fig.5 Effects of continuous cooling on contents of lactic acid of muscle in S. maximus

2.2 片段克隆結(jié)果

通過分子克隆, 得到一段長(zhǎng)度為430bp的大菱鲆wap65-1基因片段。經(jīng)過與其它物種進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證后,片段序列已經(jīng)提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù), GenBank登錄號(hào):KF879928。測(cè)序結(jié)果如下:

2.3 Wap65-1片段實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)結(jié)果

由圖6可知, 腦組織的Wap65-1表達(dá)量基本上隨溫度的降低而升高, 在 1°C時(shí)腦組織的表達(dá)量激增,顯著高于起始溫度 1000多倍(P＜0.05), 由圖 7、圖 8和圖 9可知, 胃組織、肝臟組織和頭腎組織中Wap65-1基因的表達(dá)量隨溫度降低整體呈升高趨勢(shì)。在 8°C、3°C 和 1°C 時(shí)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05), 其余溫度下Wap65-1表達(dá)量較少甚至不表達(dá)。

由圖10可知, 腎組織在降溫過程中Wap65-1表達(dá)量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 在 18°C時(shí)幾乎不表達(dá), 在5°C時(shí)的表達(dá)量最高, 且顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05), 5°C之后Wap65-1表達(dá)量有所回落但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

由圖 11可知, 脾臟組織在降溫過程中 Wap65-1表達(dá)量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 在5°C時(shí)的表達(dá)量最高, 且顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05), 5°C之后Wap65-1表達(dá)量有所回落但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖6 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆腦組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the brain tissue of S. maximus

圖7 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆胃組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the craw tissue of S. maximus

圖8 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆肝臟組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the liver tissue of S. maximus

由圖12和圖13可知, 肌肉組織和腸組織在降溫過程中Wap65-1表達(dá)量整體呈升高趨勢(shì), 其中肌肉組織 Wap65-1基因的相對(duì)表達(dá)量在 13°C時(shí)有最高值,且顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。腸組織Wap65-1基因的相對(duì)表達(dá)量在1°C時(shí)有最高值, 且顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。

圖9 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆頭腎組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.9 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the head kidney tissue of S. maximus

圖10 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆腎組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.10 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the kidney tissue of S. maximus

圖11 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆脾臟組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.11 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the spleen tissue of S. maximus

圖12 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆肌肉組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.12 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the muscle tissue of S. maximus

圖13 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆腸組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.13 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the intestine tissue of S. maximus

由圖 14可知, 心臟組織在降溫過程中 Wap65-1表達(dá)量整體呈先升高后降低的趨勢(shì), 在 13°C時(shí)表達(dá)量激增, 且顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組, 13°C、5°C 和 3°C三組溫度下 Wap65-1的表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 其余溫度下無(wú)顯著性差異。

3 討論

血清中酶活性的變化能夠反映機(jī)體新陳代謝和應(yīng)激反應(yīng)的狀況, 以及組織器官的功能狀態(tài)(惠天朝等, 2004; 冀德偉等, 2009)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要存在于肝細(xì)胞中, 是肝臟損傷的重要指示酶(劉偉等,1996)。ALT在低于 8°C的溫度區(qū)間內(nèi)的活性明顯高于初始濃度, 說(shuō)明從8°C開始, 低溫對(duì)肝功能產(chǎn)生了一定的影響甚至使之產(chǎn)生了損傷, 使肝臟中的 ALT釋放到血液中致使其濃度升高。這與何福林等研究水溫對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)血液影響的結(jié)論一致(何福林, 2007)。乳酸脫氫酶(LDH)正常情況下主要存在于心肌細(xì)胞中, 當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí), 會(huì)使其從細(xì)胞釋放到血液中, 因此可以通過測(cè)定其活性升高反應(yīng)心機(jī)細(xì)胞的受損情況及功能狀態(tài)(崔杰峰等, 2000)。LDH活性隨溫度降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 說(shuō)明降溫初期對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生了一定影響, 使其代謝加快進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加(王濤等, 2013), 冀德偉等(2009)發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下, 大黃魚(Pseudosciaena crocea)LDH活性顯著升高, 本實(shí)驗(yàn)中LDH活性顯著升高后又下降, 可能與大菱鲆對(duì)降溫過程產(chǎn)生適應(yīng)性有關(guān), 也可能與心臟功能穩(wěn)定性和對(duì)外界刺激較強(qiáng)的適應(yīng)性相關(guān)。血清肌酐(CR)是肌酸代謝產(chǎn)物, 產(chǎn)生后由腎小球排除體外, 是反映腎臟功能的重要指標(biāo)(Sano et al, 1960)。CR濃度隨溫度降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 可能在降溫初期對(duì)魚體腎臟功能產(chǎn)生一定影響, 降溫后期一方面魚體的新陳代謝降低,體內(nèi)代謝物產(chǎn)生量減少使血清中CR濃度降低, 另一方面也可能與魚體的腎臟功能對(duì)低溫產(chǎn)生適應(yīng)性有關(guān)(冀德偉等, 2009)。

血糖是機(jī)體的主要供能物質(zhì), 正常情況下, 其在血液中的濃度在一定范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激狀態(tài)下, 魚體的血糖含量明顯升高癥(洪磊等,2005; 彭士明等, 2011), 當(dāng)環(huán)境降溫初期, 生物體內(nèi)主要通過血糖分解代謝來(lái)增加產(chǎn)熱量以增強(qiáng)御寒機(jī)能, 機(jī)體在產(chǎn)熱時(shí)消耗大量葡萄糖(何福林, 2007)。隨著低溫脅迫的加強(qiáng)或脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 大量的葡萄糖被機(jī)體分解為 ATP提供能量, 而使葡萄糖濃度降低。本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖的變化規(guī)律與此規(guī)律相符, 在3°C之前隨溫度降低血漿葡萄糖總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì),說(shuō)明在3°C之前大菱鲆處于應(yīng)激狀態(tài), 溫度降低血糖含量升高以增強(qiáng)魚體的抗脅迫能力, 當(dāng)溫度繼續(xù)降低到 3°C以下, 大菱鲆機(jī)體葡萄糖代謝酶活性降低,使葡萄糖產(chǎn)生量減少且大部分血糖被分解生成 ATP,消耗量增加, 使血糖總量減少。

圖14 連續(xù)降溫對(duì)大菱鲆心臟組織Wap65-1的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.14 Effects of continuous cooling on the abundance of Wap65-1 mRNA in the heart tissue of S. maximus

Strange(1980)認(rèn)為低溫能使血清皮質(zhì)醇濃度升高。血清中皮質(zhì)醇含量的變化也是檢測(cè)應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)之一(Mansfield et al, 2010)。本實(shí)驗(yàn)中連續(xù)降溫使大菱鲆血清皮質(zhì)醇含量相對(duì)初始濃度顯著升高, 這說(shuō)明低溫使大菱鲆機(jī)體產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng), Chen等(1995)研究發(fā)現(xiàn)將鯉魚(Cyprinus carpio)置于 4°C 的水中后, 血清中的皮質(zhì)醇含量顯著升高, 這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

目前, 日益增多的魚類 Wap65基因已經(jīng)被克隆出來(lái), 人們對(duì)其結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了清楚的認(rèn)識(shí), 但其具體功能還無(wú)清楚明確的結(jié)論, 仍停留在摸索階段。Wap65基因根據(jù)其分子特征的差異可以分為多個(gè)異構(gòu)體, 常見的有Wap65-1和Wap65-2兩個(gè)異構(gòu)體, 二者除在分子特征上有所不同以外, 還有其它的差異(Paoli et al, 1999; Nakaniwa et al, 2005; Sarropoulou et al, 2010)。首先, 二者的表達(dá)特征不同, 研究發(fā)現(xiàn), 青將(Oryzias sinensis)中的Wap65-1在胚胎中的早期受精卵開始表達(dá), 而Wap65-2在原腸后期到孵化前有所表達(dá); 其次, 二者的空間表達(dá)特征有所不同, 有學(xué)者對(duì)青鳉的組織進(jìn)行原位雜交發(fā)現(xiàn): Wap65-2只在肝臟中表達(dá), Wap65-1的表達(dá)范圍較廣(Kikuchi et al,1995); 再次, 不同物種中兩種異構(gòu)體的空間表達(dá)也有差異, 例如Wap65-2只在青鳉的肝臟中表達(dá), 而在紅鰭東方鲀(Fugu rubripes)的Wap65-2在肝臟和腦中都有表達(dá)(Peatman et al, 2007, 2008)。

通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)克隆的片段進(jìn)行分析, 該基因的片段在所有組織中都有所表達(dá), 且將該基因在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn), 該基因與其它魚類的 Wap65-1基因序列相似度高達(dá) 87%, 有研究表明Wap65-1基因存在多種, 可以判斷該基因片段為Wap65-1的一種。

對(duì)不同組織中的 Wap65-1基因片段在不同溫度下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè), 結(jié)果表明: 本實(shí)驗(yàn)中所有組織的 Wap65-1基因表達(dá)量在連續(xù)降溫過程中都有不同程度的上調(diào)(腦、胃、肝臟、頭腎、腎、脾臟、肌肉、腸、心臟)。Kikuchi等(1997)將金魚從10°C放到30°C水中發(fā)現(xiàn)肝胰腺表達(dá)量升高最顯著。本實(shí)驗(yàn)中, 腦、胃和肝臟初始時(shí)表達(dá)量很少或者基本不表達(dá),只在 3—1°C時(shí)表達(dá)量大量上調(diào), 這說(shuō)明降溫到 3—1°C對(duì)這3種組織的功能穩(wěn)定性產(chǎn)生影響, 從而通過增加 Wap65-1基因表達(dá)量適應(yīng)外界環(huán)境溫度變化(Kinoshita et al, 2001)。Pierre將鱸魚(Lateolabrax japonicus)從12°C放置在30°C中一段時(shí)間, 腎臟自始至終不表達(dá), 而脾臟在第四周時(shí)開始表達(dá)(Pierre et al,2010), 而本實(shí)驗(yàn)中頭腎、腎臟和脾臟組織這3種組織在正常溫度下表達(dá)量很低甚至不表達(dá), 低溫刺激后這三種組織在特定的溫度處表達(dá)量上調(diào), 其中腎臟的分子表達(dá)結(jié)果與肌酐變化趨勢(shì)所反應(yīng)的結(jié)果一致,說(shuō)明降溫初期在一定程度上影響了機(jī)體的排泄和免疫功能, 在降溫后期, 表達(dá)量又有所回落, 可能與機(jī)體產(chǎn)生了溫度適應(yīng)性使應(yīng)激反應(yīng)減弱有關(guān)(Pierre et al, 2010)。Pierre實(shí)驗(yàn)中, 肌肉在高溫應(yīng)激下的表達(dá)呈階段性, 在應(yīng)激初期和末期表達(dá)量較高, 腸道只在末期表達(dá)量較高, 本實(shí)驗(yàn)降溫過程中肌肉和腸這2種組織的表達(dá)量整體高于對(duì)照組, 這可能與魚的種類和刺激因子的不同有關(guān)。Sha發(fā)現(xiàn)在升溫刺激下斑點(diǎn)叉尾鮰心臟表達(dá)量升高, 本實(shí)驗(yàn)中心臟Wap65-1基因表達(dá)量只在13°C時(shí)表達(dá)量激增隨后表達(dá)量減少甚至不表達(dá), 說(shuō)明心臟在降溫過程中穩(wěn)定性和適應(yīng)低溫能力較強(qiáng)(Sha et al, 2008; Díaz-Rosales et al, 2012)。

總之, 連續(xù)降溫過程使大菱鲆所有組織Wap65-1基因在特定溫度下表達(dá)量上調(diào)(腦、胃、肝臟、頭腎、腎臟、脾臟、肌肉、腸道、心臟)。其中, 腦、胃、頭腎、腎臟和心臟這5種組織中的Wap65基因在正常溫度下基本不表達(dá), 只在降溫過程中表達(dá); 肝臟、脾臟、腸道和肌肉這4種組織中的Wap65-1在正常溫度下有所表達(dá), 且隨溫度降低表達(dá)量升高。

4 結(jié)論

綜合血液生化及分子生物學(xué)指標(biāo)變化的趨勢(shì)發(fā)現(xiàn): 當(dāng)溫度在18—8°C時(shí), 降溫對(duì)大菱鲆體內(nèi)代謝影響不大; 當(dāng)溫度降到 8—3°C 時(shí), 大菱鲆開始出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng), 各種指標(biāo)變化較大; 當(dāng)溫度繼續(xù)低到1°C時(shí),各種指標(biāo)數(shù)值都基本回落到初始狀態(tài), 大菱鲆體內(nèi)的各種代謝基本處于停滯狀態(tài), 說(shuō)明1°C比較接近大菱鲆的生態(tài)冰溫點(diǎn), 可以在此溫度點(diǎn)附近進(jìn)一步進(jìn)行低溫生理及無(wú)水?；畹南嚓P(guān)探索。

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