張 沛 遲美麗 溫海深 錢 焜 倪 蒙張亞晨 黃政舉 宋志飛 柴森浩

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 青島 266003)

生長(zhǎng)激素受體(growth hormone receptor, GHR)是一種單鏈跨膜糖蛋白, 屬于細(xì)胞因子/紅細(xì)胞生成素受體超家族, 結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。哺乳動(dòng)物中僅鑒定出一種GHR, 而魚類中GHR主要分為GHR1和GHR2兩種亞型。近年來(lái), 系統(tǒng)進(jìn)化分析及結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究表明, GHR1可能為生長(zhǎng)催乳素受體(somatolactin receptor, SLR), GHR2才是生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)真正的受體(Fukamachi et al,2005, 2007)。玉麗體魚(Cichlasoma dimerus) (Rhee et al, 2012)和莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)(Pierce et al, 2007)研究也表明GHR1實(shí)際為SLR。生長(zhǎng)催乳素由腺垂體分泌, 為魚類特有激素, 屬于生長(zhǎng)激素家族。動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育可通過(guò)GH/IGF軸介導(dǎo)。GH是由生長(zhǎng)激素釋放激素誘導(dǎo)垂體分泌的蛋白類激素。GH與靶細(xì)胞表面生長(zhǎng)激素受體(GHR)結(jié)合, 通過(guò)JAK2/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 激發(fā)靶細(xì)胞合成胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor, IGF), 再通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)靶組織, 促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。GHR為GH/IGF軸中心環(huán)節(jié), 在生長(zhǎng)內(nèi)分泌調(diào)控中發(fā)揮重要作用。GH在高滲適應(yīng)中有重要作用(McCormick,2001), 研究表明GH可參與滲透壓調(diào)控, 環(huán)境鹽度變化可改變垂體GH細(xì)胞數(shù)量及血漿GH濃度, 且這種改變存在種間差異(Mancera et al, 1998)。急性高鹽度刺激可上調(diào)巴西牙鲆(Paralichthys orbignyanus)GH、GHR和IGF-1基因轉(zhuǎn)錄(Meier et al, 2009)。

高鹽度可促進(jìn)虹鱒(Oncorhynchus mykiss) GHR1 mRNA表達(dá), 進(jìn)而提高鰓中 Na+-K+-ATP酶α1a mRNA水平(Flores et al, 2012)。GH轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Danio rerio)的高滲及代謝調(diào)節(jié)能力顯著提升(Daniela et al, 2013)。鹽度升高可提高尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)血漿GH, 進(jìn)而提高GHR mRNA水平, 而莫桑比克羅非魚無(wú)變化(Breves et al, 2010)。低滲適應(yīng)是否受GH/IGF軸信號(hào)通路調(diào)控研究較少, 且GHR可能的滲透壓調(diào)控作用是否通過(guò)上下游的GH和IGF介導(dǎo)尚有待探明。

花鱸(Lateolabrax maculatus)為東北亞特有種類,主要分布于中國(guó)、日本、朝鮮沿海, 屬?gòu)V溫廣鹽性淺海近岸中下層魚類, 為我國(guó)南、北方重要的網(wǎng)箱與池塘養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一(張美昭等, 2001)?；|因其肉質(zhì)鮮美, 頗受消費(fèi)者的喜愛, 社會(huì)需求日益增加。目前, 花鱸形態(tài)學(xué)、飼料與養(yǎng)殖技術(shù)方面研究較多, 而鹽度對(duì)花鱸生理影響的研究較少。杜濤等(2013)研究了不同鹽度下1齡花鱸生長(zhǎng)特性的差異, 表明其最適生長(zhǎng)鹽度為 16—17, 而花鱸鹽度調(diào)控生理分子機(jī)制研究尚未見報(bào)道。我國(guó)沿?；|產(chǎn)量有限, 且南方沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的花鱸種質(zhì)退化, 抗病力降低, 花鱸淡水養(yǎng)殖有待研究。內(nèi)陸多地開始探索淡水養(yǎng)殖花鱸。而淡水馴化將引起花鱸內(nèi)分泌改變。GHR作為調(diào)控生長(zhǎng)的GH/IGF軸重要的中間環(huán)節(jié), 在生長(zhǎng)內(nèi)分泌調(diào)控中發(fā)揮重要作用。然而, 有關(guān) GHR在滲透壓調(diào)控中的作用研究較少。

本研究克隆得到花鱸GHR1和GHR2基因, 并對(duì)其序列進(jìn)行分析, 探究了低鹽度調(diào)控后GHRs及上下游基因 GH和 IGF-1表達(dá)差異, 旨在為研究花鱸GH/IGF軸在鹽度適應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ), 同時(shí)為花鱸淡水馴化養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

從山東省青島市膠南近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的同規(guī)格、健康花鱸 78尾, 平均體重為(803.5±49.8)g, 平均體長(zhǎng)為(40.5±1.4)cm。在實(shí)驗(yàn)室水族箱中海水暫養(yǎng), 期間禁食。實(shí)驗(yàn)用海水為沙濾自然海水(鹽度32), 淡水為曝氣后自來(lái)水, 實(shí)驗(yàn)溫度為(17.5±0.4)°C。暫養(yǎng)3d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先取6尾作為實(shí)驗(yàn)原點(diǎn), 實(shí)驗(yàn)分為3組:海水組、半海水組和淡水組, 每組設(shè)4個(gè)平行水族箱(0.6×0.8×1.0)m3, 每個(gè)水族箱放養(yǎng) 6尾花鱸。海水組鹽度不變; 半海水組和淡水組每12h鹽度分別降低4、8, 降至16、0后保持穩(wěn)定。每天9:00和21:00各換水 3/4, 各鹽度實(shí)驗(yàn)用水以海水和淡水按比例混勻調(diào)溫后加入水族箱。24、48、96、144、192h時(shí), 每實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選4尾, 早晨8:00采樣, MS-222麻醉解剖取14個(gè)組織(腸、脾、肌肉、心臟、胃、精巢、肝臟、鰓、腦、盲腸、頭腎、腎、胸腺、垂體), 樣品液氮冷凍后–80°C冰箱保存。

表1 花鱸基因克隆與熒光定量引物Tab.1 Primers used for cloning and qPCR of seabass

1.2 花鱸GHRs cDNA克隆

取花鱸肝臟, Trizol法提取總 RNA, Biodropsis BD-1000核算測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。用PrimerScript RT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后–80°C冰箱保存。取肝臟總RNA, 用SmartTMRace cDNA Amplification kit試劑盒, 依說(shuō)明書合成全長(zhǎng)克隆cDNA模板。

參照近緣?mèng)~類GHRs氨基酸序列, 用CODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)。片段克隆PCR反應(yīng): 94°C預(yù)變性 5 min; 94°C30s, Tm30s, 72°C60s, 35 個(gè)循環(huán);72°C10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物;SAGECREATION電泳凝膠成像系統(tǒng)分析獲得目的條帶, 目的片段產(chǎn)物利用TIANgel Midi Purification kit進(jìn)行凝膠回收; 連接 pEASY-T1載體; 轉(zhuǎn)化到 Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞; 氨芐抗性固體培養(yǎng)基 37°C過(guò)夜培養(yǎng);挑菌以氨芐抗性液體培養(yǎng)基培養(yǎng); 菌體 PCR檢測(cè);陽(yáng)性菌液送北京華大基因科技公司測(cè)序。

用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒擴(kuò)增 5’端和 3’端。據(jù)獲得 GHRs片段, 用 Primer5設(shè)計(jì)與試劑盒中UPM匹配引物(表1), RACE PCR反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明。RACE PCR產(chǎn)物測(cè)序同片段克隆。DNAMAN拼接基因獲得基因全長(zhǎng)。

1.3 GHRs基因序列分析

用 DNAMAN預(yù)測(cè)開放閱讀框并推測(cè)氨基酸序列, 用Signal P 4.1 server分析信號(hào)肽; 用Scratch程序預(yù)測(cè)二硫鍵。預(yù)測(cè)的氨基酸序列在NCBI進(jìn)行Blast搜索, 用 DNAMAN將其與其它物種GHRs氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。選取部分物種GHRs氨基酸序列, 用Clustal X和MEGA 4.0軟件, 以鄰接法(Neighbour-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用DNAMAN進(jìn)行同源性分析。

1.4 GHRs、IGF-1、GH熒光實(shí)時(shí)定量PCR

據(jù)花鱸GHRs、GH (GenBank: L43629)和 IGF-1(GenBank: JQ327805)cDNA序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物(表1)。以β-actin為內(nèi)參基因, 檢測(cè)花鱸14個(gè)組織中GHRs表達(dá)水平, 并檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組肝臟中GHR1,2, IGF-1和垂體中 GH表達(dá)水平。用 SYBR Green Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒, 在ABI step one plus實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng), 實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。各基因熒光定量采用兩步法, PCR程序: 94°C 30s, 94°C 5s,Tm30s, 40個(gè)循環(huán); 溶解步驟。用2-ΔΔCt法處理各基因熒光定量所得數(shù)據(jù), 并分析擴(kuò)增效率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示,SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析, 進(jìn)行Duncan’s多重比較, 當(dāng)P＜0.05時(shí), 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 花鱸GHR1、GHR2 cDNA結(jié)構(gòu)分析

克隆得到花鱸GHR1 cDNA全長(zhǎng)序列2436bp, 其中編碼區(qū)1911bp, 編碼637個(gè)氨基酸; GHR2 cDNA全長(zhǎng)序列2940bp, 其中編碼區(qū)1746bp, 編碼582個(gè)氨基酸。序列已經(jīng)提交到GenBank: GHR1, KF601961;GHR2, KF770840。GHRs氨基酸序列結(jié)構(gòu)及多序列比對(duì)分析如圖1所示。花鱸GHRs由信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成。前端信號(hào)肽氨基酸, GHR1為28個(gè), GHR2為19個(gè)。胞外區(qū)在靠近跨膜區(qū)的位置有一個(gè)保守的區(qū)域, GHR1中為 FGEFS, GHR2中為FGGFS。胞外區(qū)半胱氨酸殘基, GHR1有7個(gè), GHR2有6個(gè)。胞外糖基化位點(diǎn), GHR1有6個(gè), GHR2有4個(gè)?？缒そY(jié)構(gòu)域氨基酸同源性較低。胞內(nèi)區(qū)有保守Box1和Box2。胞內(nèi)酪氨酸殘基, GHR1有8個(gè), GHR2有4個(gè)。胞外半胱氨酸殘基位點(diǎn)(GHR1: 1、2、3、4、5、6、8, GHR2: 1、2、3、4、7、8)。胞外糖基化位點(diǎn)(GHR1: 1、3、4、5、6、7, GHR2: 1、2、5、6)。胞內(nèi)酪氨酸殘基位點(diǎn)(GHR1: 1、2、3、4、5、6、7、8, GHR2: 2、4、5、8)。GHRs氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化分析如圖 2所示, 硬骨魚類 GHR1為一支, 硬骨魚類GHR2為一支, 而達(dá)氏鰉與高等脊椎動(dòng)物為一支。系統(tǒng)進(jìn)化樹符合物種間傳統(tǒng)分類地位?；| GHR1與GHR2間氨基酸序列同源性為36.09%。

2.2 GHRs mRNA組織表達(dá)模式

花鱸各組織表達(dá)結(jié)果如圖3所示, 14個(gè)組織中均檢測(cè)到GHRs mRNA表達(dá), 但GHR1和GHR2組織分布存在差異。GHR1在腦中表達(dá)最高, 其次為垂體、胃、肝臟、腎、盲腸、鰓、心臟, 在腸、頭腎、胸腺、脾、肌肉、精巢中表達(dá)較低。GHR2在肌肉中表達(dá)最高, 其次為垂體、肝臟、盲腸、心臟、胸腺、胃, 在腸、腦、腎、脾、鰓、頭腎、精巢中表達(dá)較低。其中, 腦、腎、鰓中 GHR1表達(dá)明顯高于 GHR2; 而在肌肉、垂體、肝臟、盲腸、胸腺、心臟中, GHR2表達(dá)明顯高于GHR1。

2.3 低鹽度調(diào)控花鱸GHRs、IGF-1、GH表達(dá)規(guī)律

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了急性低鹽度調(diào)控后花鱸肝臟中GHR1、GHR2和IGF-1及垂體中GH的轉(zhuǎn)錄水平(圖4)。24h時(shí), 各組GHR1保持穩(wěn)定, 而 GHR2、GH、IGF-1顯著下降。淡水組和半海水組GHR1mRNA在96h后均顯著高于海水組。且在96h和192h時(shí), 淡水組 GHR1顯著高于半海水組。淡水組 GHR2 mRNA在 96h后顯著高于海水組和半海水組, 半海水組GHR2 mRNA在144h后顯著高于海水組, 且在144h和192h淡水組與半海水組間無(wú)顯著差異。淡水組GH mRNA在 96h后顯著低于海水組, 半海水組 GH mRNA在144h后顯著高于海水組, 且在144h和192h淡水組與半海水組間無(wú)顯著差異。淡水組 IGF-1mRNA在192h顯著高于海水組和半海水組, 半海水組IGF-1 mRNA在144h和192h顯著高于海水組和淡水組, 且在192h時(shí)淡水組與半海水組間無(wú)顯著差異。

圖1 GHRs氨基酸多序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of GHRs

3 討論

3.1 花鱸GHRs結(jié)構(gòu)及組織分布

首次克隆得到花鱸GHR1與GHR2基因, 并研究了二者差異。GHR1與GHR2間氨基酸序列結(jié)構(gòu)上存在差異。胞外半胱氨酸殘基數(shù)量GHR1比GHR2多一個(gè), 兩基因在 5個(gè)位點(diǎn)半胱氨酸殘基保持一致, 在 3個(gè)位點(diǎn)存在差異, 而多序列比對(duì)顯示物種間共4個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)高度保守, 不同位點(diǎn)半胱氨酸殘基構(gòu)成二硫鍵不同, 可能改變空間結(jié)構(gòu), 造成功能差異。胞外N-糖基化位點(diǎn)GHR1比GHR2多2個(gè), 這種不同可能造成GHRs在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的差異。BOX1富含脯氨酸(P), 在整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程起關(guān)鍵作用; Box2是與受體的內(nèi)化作用相關(guān)。多序列比對(duì)表明物種間BOX1序列同源性較高, 而Box2保守性較差。胞內(nèi)酪氨酸殘基, GHR1有比GHR2多4個(gè), 酪氨酸殘基的磷酸化作用可為信號(hào)傳導(dǎo)提供?？课稽c(diǎn)(Wang et al, 1996)。因此, GHRs胞內(nèi)酪氨酸數(shù)目的差異可能影響GH與GHRs結(jié)合。多物種間GHRs氨基酸序列比對(duì)表明 GHRs相對(duì)保守性存在較大的種間差異, 物種間GHRs功能是否存在差異有待研究?；|GHR1與GHR2同源性僅為30.09%。黃鰭鯛(Sparus latus)GHR1與 GHR2間同源性為 36.7%(馬細(xì)蘭等,2011)。而魚類種間GHR1同源性和種間GHR2同源性均較高, 表明GHR1和GHR2在進(jìn)化中差異較大。

進(jìn)化樹分析顯示, 硬骨魚類GHR1和GHR2分為明顯的兩支, 表明種內(nèi)GHRs亞型間差異較大, 而種間GHRs差異較小。硬骨魚GHR2與高等動(dòng)物GHR親緣關(guān)系較近, 暗示GHR2為魚類GH受體, 而魚類GHR1可能為SL受體。魚類GHRs的確定尚需從更多魚類中驗(yàn)證。

圖2 GHRs氨基酸N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The Neighbor-joining tree of deduced amino acid sequences of GHRs

圖3 花鱸各組織GHRs mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of GHRs mRNA in tissues of seabass

花鱸GHR1和GHR2組織分布不同, 推測(cè)其功能可能存在差異。腦、鰓和腎中GHR1顯著高于GHR2,而鰓和腎是重要的滲透壓調(diào)節(jié)器官, 推測(cè)GHR1可能更多地參與滲透壓調(diào)控; 腦中高表達(dá), 推測(cè)其負(fù)反饋調(diào)控中樞可能在下丘腦。肌肉、心臟、肝臟、盲腸、胸腺和垂體中GHR2高于GHR1, 而這些均為GH/IGF軸中重要的功能器官, 推測(cè)GHR2更多在生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用。此外, 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)(Li et al, 2007)、黃鰭鯛(馬細(xì)蘭等, 2011)、黑鯛(Acanthopagrus schlegelii) (Jiao et al, 2006)、尼羅羅非魚(Ma et al, 2007)等魚類研究同樣表明了GHR1與GHR2的組織分布存在差異, 且存在種間特異性。

圖4 肝臟GHR1、GHR2和IGF-1及垂體GH相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative mRNA expression of GHR1, GHR2, IGF-1 in live and GH in pituitary

3.2 低滲調(diào)控花鱸GH/IGF軸表達(dá)改變

本實(shí)驗(yàn)中24h時(shí), 各組GHR1表達(dá)保持穩(wěn)定, 而GHR2、GH、IGF-1顯著下降。有研究表明慢性脅迫及外源皮質(zhì)醇(Cortisol, Cor)處理可以大幅降低魚體生長(zhǎng)率(Mommsen et al, 1999), 這可能包含皮質(zhì)醇與GH/IGF軸間的交互作用。Peterson等(2005)報(bào)道, 高水平外源Cor可降低斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)垂體 GHmRNA表達(dá)。許多調(diào)控因素都可升高魚體Cor, 即使是對(duì)照組也經(jīng)常會(huì)檢出高的 Cor水平(Hori et al, 2008; LeBlanc et al, 2011)。推測(cè)實(shí)驗(yàn)組魚體受低滲誘導(dǎo)后, 可能會(huì)出現(xiàn)高 Cor水平, 抑制 GH表達(dá),進(jìn)而抑制 GHR2表達(dá)降低, 但未引起 GHR1表達(dá)改變。在24h時(shí), 低滲調(diào)控可能抑制了GH/IGF軸表達(dá)。據(jù)此推測(cè), IFG-1表達(dá)降低可能是通過(guò)GH對(duì)GHR2的調(diào)控通路實(shí)現(xiàn)的, 同時(shí)暗示了GHR2可能為GH的真正受體。

24h后, 相對(duì)于海水組, 淡水組和半海水組GHRs和IGF-1表達(dá)隨調(diào)控時(shí)間而升高, 而GH則表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。哺乳動(dòng)物研究中, 小鼠(Mus musculus)腎臟(Butler et al, 1996)和雞(Gallus gallus)肝臟(Mao et al,1997)中發(fā)現(xiàn)GH與GHR負(fù)相關(guān)。魚類中, 莫桑比克羅非魚在低滲適應(yīng)中也發(fā)現(xiàn)GH與GHR負(fù)相關(guān)(Pierce et al, 2007)。GH與GHRs間關(guān)系較為復(fù)雜, 可能受其它因素干擾。羅非魚進(jìn)行Cor注射后, 其肝臟IGF-1表達(dá)降低, 并呈現(xiàn)出劑量依賴性, 而血漿GH含量未改變, 表明 Cor可能造成 GH抵抗(Kajimura et al,2003)。因此, GHRs變化, 可能是通過(guò)改變 GHR對(duì)GH反應(yīng)的敏感性。此外, GHRs改變也可能并非僅有GH誘導(dǎo)一種途徑, 而是通過(guò)其它因子介導(dǎo)調(diào)控。據(jù)此推測(cè), 低滲調(diào)控可激活GHRs轉(zhuǎn)錄, 而GHRs的增加并非通過(guò)GH對(duì)GHRs誘導(dǎo)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn), 可能是低滲調(diào)控直接誘導(dǎo)上調(diào)了GH與GHR的結(jié)合敏感性或通過(guò)其它因子介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)增加GHRs轉(zhuǎn)錄, 進(jìn)而激活下游IGF-1表達(dá), 增強(qiáng)低滲調(diào)節(jié)能力。GH的滲透調(diào)節(jié)能力有可能是通過(guò)滲透調(diào)控誘導(dǎo)GHRs表達(dá), 并激活下游通路來(lái)實(shí)現(xiàn)?；|滲透調(diào)節(jié)能力可能是通過(guò)增加GHRs而增加的。

此外, 在實(shí)驗(yàn)后期, 淡水組GHRs和IGF-1表達(dá)要高于海水組, 而淡水組GH含量要低于半海水組。半海水組鹽度理論上為花鱸生長(zhǎng)最適宜鹽度。如果僅從生長(zhǎng)方面分析, 半海水組GH/IGF軸中各因子應(yīng)表現(xiàn)出更高的含量, 但實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到可反映其更適宜花鱸生長(zhǎng)的GH/IGF軸指標(biāo)。據(jù)此推測(cè), 可能是急性的低滲調(diào)控占主導(dǎo)作用, 實(shí)驗(yàn)中花鱸尚未能完全適應(yīng)鹽度改變, GH/IGF軸的生長(zhǎng)調(diào)控功能尚未恢復(fù)到正常水平。

本研究克隆出花鱸GHR1和GHR2基因, 并探究了低鹽度調(diào)控后 GH/IGF軸部分相關(guān)基因的表達(dá)情況。同時(shí), 對(duì)GH/IGF軸在花鱸低滲調(diào)控中的作用進(jìn)行分析, 而更為系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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