盧 靜 黎中寶① 陳 強(qiáng) 李文靜 黃永春

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門(mén) 361021; 2. 福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)試驗(yàn)室 廈門(mén) 361021)

作為一種安全、天然的飼料添加劑, 酶制劑不但有助于解決飼料資源短缺問(wèn)題, 提高飼料利用率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng), 而且具有減少環(huán)境污染, 無(wú)任何毒副作用的優(yōu)點(diǎn), 也因此被廣泛地應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖(黎中寶,2004)。研究顯示, 添加復(fù)合酶制劑可以補(bǔ)充斷奶仔豬其腸道內(nèi)源酶的不足, 減輕斷奶仔豬應(yīng)激, 促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)(周芬, 2008; 陳權(quán)軍等, 2012)。根據(jù)酶的作用機(jī)制及魚(yú)類特有的生理、生活特點(diǎn), 開(kāi)發(fā)出適用魚(yú)類的飼用酶制劑對(duì)水產(chǎn)業(yè)的綠色增產(chǎn)、提升效益具有現(xiàn)實(shí)意義。此外, 水產(chǎn)飼料具有蛋白質(zhì)含量高的特點(diǎn), 加入含蛋白酶的復(fù)合酶制劑能夠彌補(bǔ)水產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性蛋白酶的分泌不足, 提高蛋白源的利用率, 其含有的其它外源酶則能夠分解其中的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子, 從而促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的消化吸收, 提高飼料效率, 促進(jìn)生長(zhǎng)(Farhangi et al, 2007; Lin et al, 2007;周金敏等, 2012)。

國(guó)內(nèi)外對(duì)復(fù)合酶制劑添加劑的研究呈逐年漸增趨勢(shì), Carter等(1994)在豆粕替代魚(yú)粉的飼料中添加復(fù)合酶制劑, 鮭魚(yú)(Oncrohynchus mykiss)增長(zhǎng)顯著,飼料轉(zhuǎn)化率也得到提高, 甚至可使飼料媲美純魚(yú)粉飼料的投喂效果。Yildirim 等(2010)在飼料中額外添加復(fù)合酶制劑(含木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶等)能顯著提高非洲鯰(Oreochromis niloticus×O.aureus)生長(zhǎng)性能和飼料轉(zhuǎn)化率。近幾年國(guó)內(nèi)在黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)(徐黎明, 2013)、青魚(yú)(Mylopharyngodon piceus)(陳建明等, 2009)、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)(王紀(jì)亭等, 2009)、異育銀鯽(Allogynogenetic crucian)(王愛(ài)民等, 2006)等魚(yú)種的研究均表明合理使用酶制劑能提高水產(chǎn)動(dòng)物消化能力、促進(jìn)飼料養(yǎng)分的吸收, 甚至在一定程度上提高魚(yú)類免疫水平, 加速魚(yú)類的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)以歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)為研究對(duì)象, 探討飼料中添加不同水平的復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺生長(zhǎng)性能、消化酶活性和免疫的影響, 為復(fù)合酶制劑在歐洲鰻鱺水產(chǎn)配合飼料中的使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)及飼喂管理

試驗(yàn)用魚(yú)初始體重為(6.38±0.26)g, 購(gòu)于福建省龍巖市一養(yǎng)鰻場(chǎng)。試驗(yàn)地點(diǎn)為集美大學(xué)海水試驗(yàn)場(chǎng), 正式試驗(yàn)前將幼鰻暫養(yǎng)于循環(huán)過(guò)濾缸(1200L)中15d。暫養(yǎng)期間, 每天定時(shí)2次(8:00, 18:00)投喂基礎(chǔ)飼料。

暫養(yǎng)結(jié)束后挑選健康、規(guī)格基本一致的幼鰻540尾, 隨機(jī)分到18個(gè)帶有過(guò)濾系統(tǒng)的水族缸中(有效體積 120L), 并隨機(jī)分為 6個(gè)處理, 其中每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù), 每重復(fù) 30尾鰻魚(yú)。正式試驗(yàn)期間每天早晚各飽食投喂一次(8:00, 18:00), 將粉狀飼料加水?dāng)嚢柚瞥蓤F(tuán)狀飼料進(jìn)行投喂, 待魚(yú)攝食25min后吸去殘餌和糞便, 并換水1/5。試驗(yàn)期間光照為室內(nèi)自然光源, 水溫 21.5—24.5°C, 溶氧濃度＞7.0mg/L, 氨氮濃度＜0.21mg/L, pH 7.9—8.1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼料

復(fù)合酶制劑(溢多酶), 主要包括中性蛋白酶和酸性蛋白酶, 兼具纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶,由廣州溢多利生物股份有限公司提供; 基礎(chǔ)飼料(鰻鱺配合飼料), 由福建天馬飼料公司提供(主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1)。將復(fù)合酶制劑與基礎(chǔ)飼料按逐級(jí)擴(kuò)大法混勻, 配制成對(duì)照組(0%)、Diet 1 (0.05%)、Diet 2 (0.10%)、Diet 3 (0.15%)、Diet 4 (0.20%)、Diet 5 (0.25%)六種飼料, 于密封袋內(nèi)–4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 歐洲鰻鱺基礎(chǔ)飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分(干重%)Tab.1 The proximate ingredients of basal diet for A. anguilla(dry weight %)

1.3 樣品采集及處理

投喂 42d后禁食 24h, 對(duì)整缸魚(yú)稱重和計(jì)數(shù), 每缸隨機(jī)撈取 6尾用丁香酚麻醉處理, 待魚(yú)側(cè)翻, 稱重、量體長(zhǎng), 并用1ml注射器尾部靜脈采血, 所采血液放于1.5mL滅菌離心管中, 4°C靜置8h后, 3000r/min、10min、4°C分離得血清, 將收集的血清以缸為單位進(jìn)行合并, 保存于–80°C冰箱用于血清生化指標(biāo)的分析。將采血后的鰻鱺置于冰盤(pán)上解剖, 分離出肝臟和腸道, 并將肝臟稱重, 分離出的腸道快速剔除其內(nèi)溶物并立即放入液氮, 之后轉(zhuǎn)移到–80°C冰箱中保存待用。另隨機(jī)取5尾全魚(yú)保存于–20°C冰箱, 用于魚(yú)體成分分析。

腸道粗酶液的制備: 將冰水浴解凍后的腸道稱重, 加入 9倍體積(V/W)的預(yù)冷生理鹽水, 在冰水浴中勻漿 5min, 制得腸道勻漿液, 再利用低溫離心機(jī)(4°C, 4000r/min, 20min)將勻漿液離心取上清為 10%腸道粗酶液, 置–80°C冰箱保存待測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)分析 分別按以下各公式計(jì)算試驗(yàn)魚(yú)增重率(weight gain rate, WGR)、特定生長(zhǎng)率(specific growth rate, SGR)、成活率(survival rate, SR)、肝體指數(shù)(hepatosomatic indexes, HSI)和肥滿度(condition factor, CF)5種生長(zhǎng)指標(biāo):

試驗(yàn)鰻魚(yú)全體和飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定方法:粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法(總氮×6.25); 索氏抽提法(乙醚為抽提液)測(cè)粗脂肪; 馬福爐灼燒法(550°C)測(cè)粗灰分; 105°C常壓烘箱干燥恒重法測(cè)水分。

1.4.2 消化酶及血清免疫酶活性測(cè)定 胰蛋白酶活性、腸道淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)及血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)活性和血清總蛋白濃度(TP)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測(cè)定, 操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)方法 各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 若差異顯著, 則用 Duncan法進(jìn)行多重比較, 差異顯著水平P＜0.05。所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)進(jìn)行表示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺生長(zhǎng)性能的影響

經(jīng)過(guò)6周飼養(yǎng), 各組鰻魚(yú)的末均重、增重率、特定生長(zhǎng)率、肝體指數(shù)、肥滿度和成活率見(jiàn)表2。隨著復(fù)合酶制劑添加量的增加歐鰻增重率和特定生長(zhǎng)率呈先增后降趨勢(shì), Diet 1、Diet 3兩組與對(duì)照組形成顯著差異(P＜0.05)。其中Diet 3組增重率和特定生長(zhǎng)率分別比對(duì)照組提高了 34.22%和 26.36%, 并顯著高于其它組。各處理組之間的歐鰻肝體指數(shù)和肥滿度均無(wú)顯著差異(P＞0.05), 鰻鱺存活率均達(dá)到100%。

2.2 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺體成分的影響

表3為魚(yú)體水分、粗脂肪、粗蛋白和灰分含量測(cè)定結(jié)果, 飼料添加復(fù)合酶制劑降低了魚(yú)體灰分含量,除 Diet 2組外其它組歐鰻魚(yú)體灰分含量與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05), 歐洲鰻鱺魚(yú)體水分、粗脂肪及粗蛋白含量各組之間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表2 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of multi-enzyme on the growth performance of A. anguilla

表3 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺體成分的影響(濕重%)Tab.3 Effects of multi-enzyme on the whole-body composition of A. anguilla (wet weight %)

2.3 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺腸道消化酶的影響

如表 4所示, 飼料復(fù)合酶制劑顯著提高了歐洲鰻鱺腸道胰蛋白酶活性, 所有添加組歐鰻胰蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。歐鰻腸道淀粉酶活性則隨酶制劑濃度的增高呈先升后降趨勢(shì), 除Diet 5組外其它各添加組淀粉酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), Diet 2組到達(dá)最高峰值。腸道脂肪酶活性受酶制劑添加水平影響較小, 各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表4 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺腸道消化酶活性的影響Tab.4 Effects of multi-enzyme on the activities of intestinal digestive enzymes of A. anguilla

2.4 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺血清免疫指標(biāo)的影響

如表5所示, 復(fù)合酶制劑能不同程度的提高歐鰻血清免疫指標(biāo)。隨著飼料中復(fù)合酶濃度的增加, 超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升后降趨勢(shì), 各添加組SOD活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), Diet 3、Diet 4組酶活達(dá)最高水平。溶菌酶(LZM)和堿性磷酸酶(AKP)活性與 SOD活性變化趨勢(shì)趨于一致, 各添加組酶活均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 其中LZM活性在Diet 3、Diet 4組酶活均達(dá)最高水平。各添加組AKP活性和血清總蛋白濃度(TP)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), Diet 3、Diet 4組歐鰻血清AKP活性處于較高水平, Diet 3組血清TP最高且相比對(duì)照組提高了38.86%。

表5 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺免疫功能的影響Tab.5 Effects of multi-enzyme on the immune response of A. anguilla

3 討論

3.1 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺生長(zhǎng)的影響

已有研究表明, 在水產(chǎn)飼料中添加適量的復(fù)合酶制劑對(duì)養(yǎng)殖品種具有促生長(zhǎng)作用。黃顙魚(yú)增重率、特定生長(zhǎng)率和攝食量隨著飼料中復(fù)合酶制劑添加量的增加呈逐漸升高趨勢(shì), 400mg/kg劑量的酶制劑使魚(yú)增重率相比對(duì)照組顯著提高了15.4% (徐黎明, 2013)。周小秋(2001)和王紀(jì)亭等(2009)分別在鯉魚(yú)和草魚(yú)飼料中添加復(fù)合酶制劑均使魚(yú)體增重、特定生長(zhǎng)率等生長(zhǎng)指標(biāo)呈不同程度的提高。陳建明等(2009)在飼料中添加 1‰—3‰的中性蛋白酶制劑能促進(jìn)青魚(yú)生長(zhǎng)和降低飼料系數(shù), 其中添加 1‰的酶制劑能顯著提高青魚(yú)增重, 但過(guò)低或過(guò)高濃度的酶制劑并不能進(jìn)一步促進(jìn)青魚(yú)的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)選用的復(fù)合酶制劑主要成分包括中性蛋白酶和酸性蛋白酶, 兼具纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶種, 劉維德(2000)曾選取包括溢多酶及另外四種不同廠家的復(fù)合酶制劑投喂普通草魚(yú)50天, 比較得出添加1‰溢多酶組草魚(yú)生長(zhǎng)性能顯著優(yōu)于對(duì)照組及其它各處理組。本試驗(yàn)中, 隨著復(fù)合酶制劑添加量的增加歐鰻增重率和特定生長(zhǎng)率呈先增后降趨勢(shì), 其中添加量為0.15%組歐鰻增重率和特定生長(zhǎng)率分別比對(duì)照組提高了 34.22%和 26.36%, 在所有組別間達(dá)到最大, 但當(dāng)復(fù)合酶制劑超量(0.2%)添加時(shí)魚(yú)增重、特定生長(zhǎng)率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這說(shuō)明飼料中添加適量復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺有顯著的促生長(zhǎng)作用, 本試驗(yàn)條件下的復(fù)合酶制劑最優(yōu)添加量為 0.15%, 這與上述劉維德(2000)所得最佳投喂劑量接近。

關(guān)于酶制劑的促生長(zhǎng)機(jī)理, 一般認(rèn)為外源酶不但能在飼料的貯存中發(fā)揮酶效應(yīng), 對(duì)多種養(yǎng)分和抗?fàn)I養(yǎng)因子具有一定的分解作用, 可促進(jìn)飼料養(yǎng)分的消化吸收(王愛(ài)民等, 2006)。另一方面, 外源酶能夠改善魚(yú)體腸道內(nèi)源酶的分泌, 與內(nèi)源酶產(chǎn)生協(xié)同作用,加強(qiáng)腸道對(duì)飼料養(yǎng)分的消化和吸收(李曉東等, 2005;黃峰等, 2008), 具有調(diào)節(jié)體內(nèi)生理和消化代謝機(jī)能,對(duì)動(dòng)物有保健的功能(黎中寶, 2004)。

3.2 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺體成分的影響

一般來(lái)說(shuō), 在飼養(yǎng)環(huán)境十分相近的條件下, 短時(shí)期投喂的同種魚(yú), 魚(yú)體的營(yíng)養(yǎng)組成是相對(duì)穩(wěn)定的。本試驗(yàn)條件下, 投喂6周試驗(yàn)料歐鰻各組間全魚(yú)水分、粗蛋白、粗脂肪含量均沒(méi)有顯著性差異, 但灰分含量有所下降, 除Diet 2組外其它各添加組歐鰻魚(yú)體灰分含量顯著低于對(duì)照組。張建明等(2009)研究表明中性蛋白酶對(duì)青魚(yú)體成分中的水分、粗脂肪、粗蛋白及灰分含量均無(wú)顯著影響, 這與徐黎明(2013)、張麗(2008)對(duì)黃顙魚(yú)和異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的研究結(jié)果相一致。本研究中歐鰻全體的粗灰分與上述試驗(yàn)結(jié)果基本相近, 粗灰分含量的差異可能與魚(yú)種、飼料和養(yǎng)殖環(huán)境的綜合作用有關(guān), 需要進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

3.3 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺腸道消化酶的影響

配合飼料中含有的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)必須經(jīng)酶解后方能被動(dòng)物消化利用, 因酶具有嚴(yán)格的專一性和特異性, 使用單一酶系的作用效果要低于使用多酶系統(tǒng)。有研究表明, 添加外源酶不但不會(huì)引起腸道內(nèi)源酶的“反饋性”抑制, 反而能促進(jìn)內(nèi)源性消化酶的分泌(施培松, 2005), 利用各種消化酶和非消化酶的協(xié)同作用, 可最大限度地提高飼料中能量、蛋白質(zhì)和纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率, 從而達(dá)到促進(jìn)生長(zhǎng)節(jié)約飼料的目的。王愛(ài)民等(2006)在飼料中添加外源酶(β-葡聚糖酶等 8種復(fù)合酶)顯著提高了異育銀鯽中腸蛋白酶、淀粉酶活性, 降低了腸道食糜粘度, 加快食糜排空速度, 促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。由蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和果膠酶復(fù)合而成的復(fù)合酶制劑投喂黃顙魚(yú)8周后, 魚(yú)胃蛋白酶、淀粉酶和腸道蛋白酶活性均得到提高, 但魚(yú)腸道淀粉酶活性卻呈下降趨勢(shì)(徐黎明, 2013)。本試驗(yàn)所選用由中性蛋白酶和酸性蛋白酶兩種內(nèi)源酶同時(shí)兼具纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶三種外源酶組成的復(fù)合酶制劑, 投喂幼鰻 6周后, 所有添加組歐鰻腸道胰蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照組, 腸道淀粉酶活性則隨酶制劑濃度的增高呈先升后降趨勢(shì), 其中添加量為 0.1%組歐鰻腸道淀粉酶活力最高, 各添加組腸道脂肪酶活性雖相比于對(duì)照組呈略微下降趨勢(shì), 但無(wú)顯著差異。消化酶是聯(lián)系營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育的中間指標(biāo), 而鰻魚(yú)腸道消化酶受多種因素如溫度、飼料、食性、添加劑等的影響(黃永春, 2012), 本試驗(yàn)條件下在基礎(chǔ)飼料添加適量的復(fù)合酶制劑能促進(jìn)鰻鱺腸道胰蛋白酶和淀粉酶消化酶的分泌, 對(duì)腸道脂肪酶分泌影響較小?？傊?飼料添加適量濃度的復(fù)合酶制劑能夠在一定程度上促進(jìn)鰻鱺對(duì)飼料的消化吸收, 加快鰻魚(yú)生長(zhǎng)速度。

3.4 復(fù)合酶制劑對(duì)歐洲鰻鱺血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

血清中多種免疫因子在防止魚(yú)類感染, 維持機(jī)體健康中扮演著重要角色, 血清中 SOD酶活性的高低反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力, 血清 LZM 具溶菌作用可抵抗各種各樣病原菌的侵襲。鐘國(guó)芳等(2005)在羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)飼料中添加復(fù)合酶制劑(由淀粉酶、纖維素分解酶和蛋白酶組成),顯著提高了魚(yú)肝臟SOD和LZM活性。在飼料中添加200mg/kg的復(fù)合酶制劑(包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶等), 異育銀鯽血清LZM活性得到了顯著提高, 血清和脾臟 SOD酶活性均顯著高于其它各組(張麗, 2008)。本試驗(yàn)中, 隨著飼料中復(fù)合酶制劑濃度的增加, 鰻魚(yú)血清 LZM 與 SOD活性變化趨勢(shì)相一致, 均有先增后降趨勢(shì), 在復(fù)合酶制劑添加水平為0.15%、0.2%時(shí)這兩種酶活性達(dá)最高水平。另外, 血清中的AKP可通過(guò)水解作用破壞、改變有害異物的表面分子組成, 加快吞噬細(xì)胞的吞噬作用及異物的降解, 阻止病菌的繁殖從而能起到免疫防御作用(Bigij et al, 1987), 血清TP包含了血清中的各種抗病因子及具殺菌功能的酶和蛋白質(zhì), 其含量的升高表明機(jī)體蛋白質(zhì)代謝加強(qiáng), 免疫功能的提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 復(fù)合酶制劑能顯著提高血清 AKP活性, 其中 0.15%、0.2%的添加水平使歐鰻AKP活性處于較高水平。所有添加組鰻魚(yú)血清TP含量均顯著高于對(duì)照組, Diet 3組(0.15%)相比對(duì)照提高了38.86%, 與王國(guó)霞等(2013)對(duì)黃顙魚(yú)的研究結(jié)果相一致, 說(shuō)明飼料中添加適宜量的復(fù)合酶制劑能夠提高幼鰻血液的免疫酶含量, 增強(qiáng)其非特異性免疫功能。綜合上述結(jié)果,本試驗(yàn)條件下鰻魚(yú)飼料中復(fù)合酶制劑適宜添加濃度為0.15%。

王紀(jì)亭, 萬(wàn)文菊, 康明江等, 2009. 復(fù)合酶制劑對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能、飼料養(yǎng)分消化率及免疫力的影響. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),24(5): 417—422

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