高 晶 任毅鵬 潘寶平 閆春財

(天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387)

青蛤(Cyclina sinensis)是我國習(xí)見的海產(chǎn)經(jīng)濟動物, 由于其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美, 營養(yǎng)豐富, 是我國南北沿海地區(qū)人們喜愛的鮮食貝類, 目前已成為重要的海水養(yǎng)殖對象之一(宋欣等, 2010)。由于近年來沿海地區(qū)的水質(zhì)污染較為嚴(yán)重, 水生微生物病原體大量繁殖, 青蛤養(yǎng)殖業(yè)受到嚴(yán)重制約(孫國銘等, 2004)。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害的重要病原微生物之一, 常給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的損失,目前在我國江蘇等省區(qū)已經(jīng)引起青蛤的大面積病害和死亡現(xiàn)象(王蘭萍等, 2007; 羅凱婭等, 2012)。

髓樣分化因子88(myeloid differentiation 88, MyD88)是Toll樣模式識別受體(Toll-like receptor, TLR)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)免疫反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)接分子, 是信號向下游級聯(lián)反應(yīng)引發(fā)效應(yīng)分子表達(dá)的關(guān)鍵靶分子。MyD88屬于Toll/IL-1R家族, 包含N端死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD)中間區(qū)域和C端的Toll區(qū)。MyD88在Toll樣受體2, 3, 4, 7, 9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著非常重要的作用(趙興旺等, 2011)。目前, 已有多個哺乳類、禽類、魚類等動物的MyD88分子相繼被鑒別(朱炳林等, 2010),有關(guān)軟體動物MyD88分子的研究比較罕見。

本研究通過建立轉(zhuǎn)錄組文庫并從中篩選克隆得到MyD88基因的cDNA序列, 進(jìn)一步針對該基因的TIR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測。在鰻弧菌脅迫下, 利用實時熒光定量 PCR技術(shù)檢測了青蛤MyD88基因在不同組織的時序表達(dá)過程, 討論了該分子在貝類免疫信號傳導(dǎo)中的重要作用, 為深入揭示研究軟體動物的免疫應(yīng)答機制提供一定的實驗數(shù)據(jù), 同時為青蛤養(yǎng)殖中的病害防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

活體青蛤(Cyclina sinensis)采自天津大港灘涂,將其暫養(yǎng)于人工海水中, 海水密度 1.02—1.04g/cm3,水溫 21—24°C, 持續(xù)曝氣, 每天投喂 5‰的小球藻(Chlorella sp.), 一周后進(jìn)行侵染實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 侵染實驗 鰻弧菌(Vibrio anguillarum)用2216E培養(yǎng)基于 28°C下培養(yǎng) 24h后, 用無菌海水重懸菌液, 將濃度調(diào)為OD600= 0.4。實驗采用隨機分組方法, 每次試驗均設(shè) 10個平行組。實驗組青蛤注射50μL/只的鰻弧菌菌液, 對照組注射等量的滅菌生理鹽水。注射前準(zhǔn)確稱取青蛤肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓各50mg, 迅速放入液氮冷凍。注射后0h、3h、6h、12h、24h、48h、96h時提取血淋巴。取出冷凍組織在預(yù)冷勻漿器中按質(zhì)量體積比1∶9加入預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行勻漿, 4°C、4500r/min離心15min, 取上清液備用。血淋巴置于4°C條件下, 8000r/min離心10 min收集血細(xì)胞, 加入1mL Trizol, 置于 –80°C超低溫冰箱中備用。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建及數(shù)據(jù)篩選 Trizol法提取活體青蛤血淋巴總RNA, mRNA的分離按QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits試劑盒操作手冊進(jìn)行。純化后的 mRNA加入裂解緩沖液將其打斷成短片段,采用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄法合成 cDNA。純化的雙鏈cDNA再經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。采用 Illumina MiSeq二代測序儀, pair end雙端模式完成轉(zhuǎn)錄組測序。去冗余后的數(shù)據(jù)采用 Unigene編碼蛋白框 ORF預(yù)測分析, 并與 NR數(shù)據(jù)庫、Uniprot/Swissprot數(shù)據(jù)庫和Unigene ggNOG數(shù)據(jù)庫等多重BLAST分析比對,通過 Blast2GO軟件完成 Unigene的 GO注。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋信息進(jìn)一步對 Unigene進(jìn)行Pathway通路的注釋和預(yù)測, 對 Unigene進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1.2.3 MyD88基因序列分析 從轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出青蛤 MyD88基因類似序列, 設(shè)計特異性引物進(jìn)行基因克隆, 同時與 GenBank核酸數(shù)據(jù)庫作BLASTX分析, 使用開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)在線分析, ProtParam工具在線預(yù)測序列的分子式、分子量和等電點, SignalP 3.0和SMART查找信號肽及結(jié)構(gòu)域, Clustal W對氨基酸序列進(jìn)行多重比對和同源性分析, 利用 MEGA4.1以鄰接法(NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

1.2.4 MyD88基因在青蛤各組織內(nèi)的表達(dá)分析參照 1.2.1方法, 將青蛤肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓的勻漿上清液與青蛤注射后0h血細(xì)胞分別置于1mL TRIZOL中提取總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA, 以cDNA為模板, β-actin基因為內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量PCR。RT-PCR 引物分別為: β-actin-F: 5’ CACCACA ACTGCCGAGAG 3’,β-actin-R: 5’ CCGATAGTGATGA CCTGACC 3’; MyD88-F: 5’ GACCTGTGCCACCAATA 3’, MyD88-R: 5’ GGGTTCCTGGG CTTTA 3’; 反應(yīng)在Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀上進(jìn)行, 擴增體系為20μL, 反應(yīng)程序為: 95°C預(yù)變性30s, 94°C變性5s,60°C退火30s, 72°C延伸30s, 40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT法計算(Livak et al, 2001), 使用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 鰻弧菌刺激下青蛤MyD88基因在血淋巴中的時序性表達(dá) 參照 1.2.1方法, 提取鰻弧菌刺激下0h、3h、6h、12h、24h、48h、96h時血淋巴樣品, 提取總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA, 以cDNA為模板, β-actin基因為內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量PCR。RT-PCR引物參照1.2.4。反應(yīng)程序為: 95°C預(yù)變性30s, 95°C變性5s, 58°C退火30s, 72°C延伸30s, 40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT法, 使用SPSS軟件對同一時間點實驗組與對照組, 實驗組和空白組的表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 青蛤MyD88基因的結(jié)構(gòu)分析

構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫, 有893個基因注釋到15個免疫相關(guān)的通路中。經(jīng)隨機挑取克隆并測序后, 利用BLASTX比對和ORF在線分析發(fā)現(xiàn)青蛤MyD88基因部分片段。青蛤 MyD88基因 cDNA開放閱讀框為1521bp, 編碼 506個氨基酸(圖 1), 其理論分子量為57.14kDa, 理論等電點 pI=5.80, 分子式為 C2496H3912N698O806S17, 氨基酸組成中絲氨酸(Ser)最高, 占14.0%。N段存在完整的DEATH結(jié)構(gòu)域, C段存在完整的TIR結(jié)構(gòu)域。青蛤MyD88基因在GenBank中的注冊號為KJ841930。

2.2 青蛤MyD88基因的分子系統(tǒng)學(xué)分析

用MEGA4.1軟件以鄰接法(NJ)構(gòu)建了MyD88的系統(tǒng)樹(圖2), 采用bootstrap 1000個循環(huán)檢驗拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的置信度。拓?fù)鋱D顯示: 青蛤 MyD88與長牡蠣(Crassostrea gigas)、紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)聚在一個分支上; 而與魚類如紅笛鯛(Lutjanus sanguineus)、鱖魚(Siniperca chuatsi)、布氏新亮麗鯛(Neolamprologus brichardi)、斑馬魚(Danio rerio)、鯉魚(Cyprinus carpio)以及鳥類和哺乳類如原雞(Gallus gallus)、人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。而海蝸牛(Aplysia californica)則與櫛孔扇貝(Chlamys farreri)單獨聚成一支。

圖1 青蛤MyD88基因cDNA序列的開放閱讀框及功能域分析Fig.1 The open reading frame of CsMyD88 gene and analysis on the structural domain

2.3 青蛤MyD88基因在不同組織間的表達(dá)

以β-actin在各組織中的表達(dá)量為內(nèi)參對照, 利用實時熒光定量PCR分析了MyD88基因在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓五個組織的表達(dá)情況(圖3), 結(jié)果顯示MyD88基因在青蛤的以上五個組織中表達(dá)量存在明顯差異, 其中血淋巴中表達(dá)量最高,顯著高于其它組織(P＜0.05), 是表達(dá)量最低的肝臟的50倍, 外套膜表達(dá)次之。表明青蛤MyD88基因主要在血淋巴中表達(dá)。

2.4 在鰻弧菌刺激下青蛤MyD88基因在血淋巴中的時序性表達(dá)

在鰻弧菌侵染青蛤后, 以β-actin為內(nèi)參基因,利用實時熒光定量PCR分析了青蛤MyD88基因在血淋巴中的表達(dá)時序變化(圖 4)。發(fā)現(xiàn)實驗組在感染后24h表達(dá)量高于空白組; 到48h時出現(xiàn)了驟升并且達(dá)到最大值, 與對照組有極顯著性差異(P＜0.01), 約為對照組的 10倍左右; 且與空白組有極顯著性差異(P＜0.01)。96h后其表達(dá)量開始下降, 恢復(fù)并接近至正常水平。

3 討論

目前有關(guān)MyD88分子的研究報道主要集中在魚類、鳥類和哺乳動物中, 相對在軟體動物中的研究資料比較罕見, 主要集中在櫛孔扇貝(邱麗梅, 2006; 王孟強, 2010)、菲律賓蛤仔(Lee et al, 2011)、長牡蠣(Timothy et al, 2013)和紫貽貝(Mylène et al, 2014)等傳統(tǒng)養(yǎng)殖對象中。本研究通過實時定量 PCR分析了青蛤 MyD88基因在不同組織中的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓五個組織中均有表達(dá), 但在血淋巴中的表達(dá)量與其它組織有顯著性差異(P＜0.05)。該結(jié)果與櫛孔扇貝 CfToll-1的組織表達(dá)情況(邱麗梅, 2006)相似。青蛤的先天性免疫主要依賴于血淋巴的循環(huán), 其在軟體動物的內(nèi)部防御中起到至關(guān)重要的作用(Pipe et al, 1997;Wootton et al, 2003)。鰻弧菌侵染青蛤48h后, MyD88基因的相對表達(dá)量達(dá)到最大, 可能是由于鰻弧菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒素入侵青蛤血細(xì)胞后, 被一些識別因子或受體蛋白所識別, 進(jìn)一步激活了青蛤Toll通路信號傳遞, 從而引起相關(guān)因子表達(dá)量的變化, 并最終誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)。青蛤MyD88基因在鰻弧菌刺激下的表達(dá)情況與櫛孔扇貝MyD88基因在LPS刺激下的實驗結(jié)果類似(王孟強, 2010)。本研究結(jié)果同時發(fā)現(xiàn), 鰻弧菌刺激青蛤12h以內(nèi)MyD88基因的相對表達(dá)量有所下調(diào), 其結(jié)果與 PGN刺激下櫛孔扇貝MyD88和TRAF6兩種重要銜接蛋白mRNA的表達(dá)情況(邱麗梅, 2006)相似。該現(xiàn)象可能與mRNA處在動態(tài)平衡狀態(tài)有關(guān), 當(dāng)病原體入侵較短時間內(nèi), mRNA被消耗用于合成更多的蛋白從而參與機體防御。

圖2 使用鄰接法(NJ)構(gòu)建的16個物種MyD88氨基酸序列系統(tǒng)樹Fig.2 The plylogenetic tree constructed by the amino acid sequences of MyD88 of 16 species using NJ (neighbor joining) method

圖3 青蛤MyD88基因在青蛤不同組織間的表達(dá)情況Fig.3 Expression characterization of C. sinensis in organs revealed by real time PCR

圖4 青蛤血淋巴中MyD88基因在鰻弧菌刺激不同時間相對表達(dá)量的變化Fig.4 The relative expression of CsMyD88 gene in hemolymph of C. sinensis infected by V. anguillarum in different times

本研究通過構(gòu)建青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫篩選并克隆得到TLR通路信號分子MyD88的cDNA序列, 利用分子系統(tǒng)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn), 青蛤的MyD88基因與長牡蠣、紫貽貝、三角帆蚌、菲律賓蛤仔親緣關(guān)系相近, 并且與長牡蠣的 MyD88基因相似性最高, 一致性達(dá)到50%。利用 SMART在線分析軟件對青蛤 MyD88基因進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析, 發(fā)現(xiàn)青蛤 MyD88氨基酸序列N段存在DEATH結(jié)構(gòu)域, C段存在TIR結(jié)構(gòu)域。MyD88屬于Toll/IL-1R家族和死亡結(jié)構(gòu)域家族成員,MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域與TLRs和IL-1Rs的TIR結(jié)構(gòu)域相結(jié)合, 而死亡結(jié)構(gòu)域可與白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶(IL-1R-associated kinase, IRAK)的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用, 募集IRAK到受體復(fù)合體進(jìn)而介導(dǎo)信號向下游傳導(dǎo)(趙興旺等, 2011)。通過構(gòu)建系統(tǒng)樹發(fā)現(xiàn)青蛤的MyD88基因的分子進(jìn)化地位與其形態(tài)分類地位基本一致, 但與海蝸牛、櫛孔扇貝差異明顯, 說明該序列在軟體動物進(jìn)化過程中選擇壓力小的區(qū)域產(chǎn)生了明顯的變異分歧。

本研究中有關(guān)青蛤 MyD88基因在鰻弧菌脅迫下, 不同組織的時序表達(dá)過程能夠初步闡明貝類Toll通路中MyD88信號因子的傳遞特征, 為今后深入探索軟體動物的免疫應(yīng)答機制提供了重要的實驗數(shù)據(jù)。

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