劉春芳 李 翠 張 振 王海艷①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

泥蚶Tegillarca granosa (Linnaeus, 1758)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、蚶目(Arcoida)、蚶科(Arcidae), 俗稱血蚶、銀蚶、花蚶、粒蚶、血螺、瓦壟哈, 是一種營穴居生活的底棲動(dòng)物,廣泛分布于我國沿海, 在山東、浙江、福建和廣東均有養(yǎng)殖(李鳳蘭, 1983; 徐鳳山等, 2008)。泥蚶的營養(yǎng)與藥用價(jià)值高(雷煥宗等, 2004; 溫?fù)P敏等, 2009; 柯佳穎等, 2010), 是我國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一。

目前關(guān)于泥蚶不同地理群體形態(tài)變化差異與判別分析(張永普等, 2004)、生化遺傳(賈守菊等, 2003;李松偉等, 2011)以及養(yǎng)殖(尤仲杰等, 2002; 吳洪喜等,2004)的研究有大量報(bào)道。王日昕等(2005)利用同工酶分析的研究認(rèn)為, 我國沿海泥蚶以東海和南海的分界線為界, 可以分為兩個(gè)類群, 兩個(gè)類群內(nèi)部遺傳分化不明顯, 而類群間的遺傳距離較大, 而鄭文娟等(2009)對(duì)泥蚶線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I (cytochrome oxidase subunit I, COI)基因的研究則在此基礎(chǔ)上提出南北類群的分化達(dá)到了亞種甚至種的水平。Ni等(2012)對(duì)中國東海和南海兩個(gè)海區(qū)泥蚶 COI和 ITS1兩個(gè)標(biāo)記的研究, 提出了中國海區(qū)兩個(gè)泥蚶的進(jìn)化顯著單元(evolutionarily significant units, ESUs), 其中一個(gè)ESU廣泛分布中國沿海, 而另一ESU則分布在南海海域, 后者瀕臨消失。

線粒體DNA (mtDNA)是一種共價(jià)閉環(huán)雙鏈DNA分子, 由于其相對(duì)于核基因具有遵循嚴(yán)格的母系遺傳、幾乎沒有重組、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快以及在不同的區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn), 逐漸成為種群遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)發(fā)育研究的重要標(biāo)記(Avise,2000)。線粒體 COI基因具有進(jìn)化速度較快, 有相對(duì)保守區(qū)等特點(diǎn), 可作為種屬系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記(Martínez-Navarro et al, 2005), 目前被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、分子系統(tǒng)發(fā)育分析(Matsumoto, 2003; Cho et al, 2007)。目前關(guān)于中國沿海泥蚶群體的遺傳分化研究仍不夠全面, 本研究利用線粒體 COI基因分析中國沿海泥蚶7個(gè)群體遺傳多樣性, 以期為泥蚶的分類、遺傳多樣性研究及合理、有效地利用和保護(hù)泥蚶種質(zhì)資源提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

樣品分別采集于海南?？谑小V西防城港市、廣西北海市、廣東湛江市、福建漳州市、山東榮成市和山東威海市。樣品采集后立即用75%酒精固定, 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA的提取、擴(kuò)增及測序

取泥蚶閉殼肌肌肉約100mg充分剪碎, 用TIANamp海洋動(dòng)物DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)提取全基因組。線粒體COI基因擴(kuò)增引物L(fēng)CO1490和HCO2198 (Folmer et al, 1994)序列分別為:5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′, 和5′-AAAC TTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′, 由上海桑尼生物技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系為: 總體積25μL, 其中2μL 10× PCR緩沖液, 1.5mmol/L Mg2+, 200μmol/L dNTPs, 1U Taq DNA 聚合酶, 正反向引物各0.4μmol/L,2μL模板DNA溶液(10—100ng/μL)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min; 94°C 40s, 48°C 1min, 72°C 1min, 30個(gè)循環(huán); 然后72°C延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海桑尼生物技術(shù)公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列結(jié)果利用Mega 5.1軟件進(jìn)行同源排序比對(duì),同時(shí)輔以人工校對(duì)。采用Kimura 2-paramter (K2P)(Kimura, 1980)距離矩陣計(jì)算群體內(nèi)和群體間遺傳距離, 并結(jié)合非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Means, UPGMA)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

采用DnaSP 5.1軟件計(jì)算單倍型多樣性指數(shù)(Haplotype diversity, Hd)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、不同群體序列的堿基組成、變異位點(diǎn), 并通過Mega 5.1軟件基于K2P方法利用26個(gè)單倍型序列構(gòu)建NJ樹和UPGMA樹。

用Arlequin 3.1軟件計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)(F-statistics, Fst)及其顯著性(重復(fù)次數(shù)為1000), 并用分子變異分析(AMOVA)方法估算遺傳變異在群體間和群體內(nèi)的分布。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 線粒體COI基因片段的序列特征以及單倍型分析

經(jīng)序列比對(duì)與分析后, 得到長度為592bp的泥蚶COI基因片段, 其中共有16個(gè)單突變位點(diǎn), 87個(gè)簡約信息位點(diǎn)。在所有群體的序列中, A+T含量(表 1)平均為60.83%。

表1 7個(gè)泥蚶群體COI基因片段序列堿基組成(%)Tab.1 Percentage of base composition of partial COI gene sequences in the seven T. granosa populations

多態(tài)性遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)(表 2)顯示, 62個(gè)個(gè)體共檢出26個(gè)單倍型, 群體間共享單倍型4個(gè), 占單倍型總數(shù)的15.4%, 其余22個(gè)單倍型均為某個(gè)群體所特有。單倍型Hap5為2個(gè)群體(防城港、威海)共享, 單倍型Hap8為4個(gè)群體(防城港、北海、漳州、威海)共享, 單倍型 Hap13為 2個(gè)群體(海南、北海)共享, 單倍型Hap14為 5個(gè)群體(防城港、北海、漳州、威海、榮成)共享。26個(gè)單倍型中, 共享單倍型Hap14的個(gè)體總數(shù)最多, 占分析個(gè)體總數(shù)的35.5%。

2.2 群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)

群體內(nèi)和平均遺傳多樣性參數(shù)見表 3, 南方類群(防城港、北海、海南和湛江)的遺傳多樣性參數(shù)普遍較高: Hd為0.914—1.000, 多態(tài)位點(diǎn)比例為1.18—15.7,Pi為0.01182—0.07095, K值為7.0000—42.00); 而北方類群(榮成和威海)的遺傳多樣性參數(shù)則較低: Hd為0.532和1.000, 多態(tài)位點(diǎn)比例為0.507和0.338, Pi為0.00124和0.00338, K值為0.73684,和2.000, 漳州群體遺傳參數(shù)居中(Pi和K值較榮成群體略低)。

表2 泥蚶26個(gè)獨(dú)立單倍型在7個(gè)群體中的分布Tab.2 Distribution of 26 unique haplotypes of COI sequences across the seven T. granosa populations

表3 基于COI基因片段序列的7個(gè)泥蚶群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 The genetic diversity parameters of partial COI gene in the seven populations of T. granosa

根據(jù)K2P方法, 利用Mega 5.1計(jì)算群體內(nèi)、群體間遺傳距離以及群體分化系數(shù)Fst見表 4。威海泥蚶群體內(nèi)遺傳距離最低, 海南群體內(nèi)遺傳距離最高; 榮成群體和威海群體之間的遺傳距離最近, 漳州群體與兩者之間的遺傳距離次之; 北海群體、海南群體與其他群體的遺傳距離普遍較高, 而兩者群體內(nèi)遺傳距離最高; 防城港泥蚶群體內(nèi)遺傳距離大于與其他群體(北海和海南兩個(gè)群體除外)之間的遺傳距離; 湛江與漳州、威海、榮成的遺傳距離均小于與北海和海南兩個(gè)群體的遺傳距離。而在群體間遺傳距離關(guān)系在UPGMA聚類樹中威海和榮成群體聚成一個(gè)小支, 之后依次和漳州、湛江、防城港和北海、海南聚在一起(圖 1)。

表4 基于COI基因片段序列的7個(gè)泥蚶群體間遺傳距離(對(duì)角線下)、群體內(nèi)遺傳距離(粗體顯示)和群體間分化系數(shù)(對(duì)角線上)Tab.4 Genetic distances between populations (below diagonal), genetic distances within populations (in bold values) and pair-wise Fst (above the diagonal) of the seven populations of T. granosa based on partial COI gene

圖1 基于泥蚶7個(gè)群體遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram based on genetic distances of seven populations of T. granosa

利用Tamura & Nei (Tamura et al., 1993)計(jì)算方法,得到群體間遺傳分化系數(shù)Fst(表4)及其顯著性(未列出)。群體遺傳學(xué)認(rèn)為, 可以根據(jù)Fst值將群體間分化程度分為4個(gè)等級(jí): 較弱(0—0.05), 中等(0.05—0.15),較大(0.15—0.25)和極大(＞0.25)。湛江群體與威海群體遺傳分化最高, 漳州群體除與防城港群體無明顯分化, 同其他群體分化極大。防城港群體與威海群體存在中等分化, 同其他群體間的遺傳分化較弱。

基于Tamura & Nei計(jì)算方法的AMOVA分析(表5)表明, 泥蚶群體遺傳分化的 90.51%來自群體內(nèi)部,僅有9.49%來自群體間。說明, 泥蚶群體遺傳分化主要表現(xiàn)為群體內(nèi)分化, 群體內(nèi)部遺傳多態(tài)性較高。采用鄰接法(NJ)和非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建的泥蚶7個(gè)群體26個(gè)單倍型的分子系統(tǒng)樹見圖2,3。在兩種樹中, 所有的26個(gè)單倍型被分成兩個(gè)分支,Hap2, Hap11和Hap12聚在一支, 其余單倍型聚成一大支, 大支在NJ樹和UPGMA樹中有變化。

表5 基于COI基因片段序列的7個(gè)泥蚶群體遺傳變異的AMOVA分析Tab.5 Hierarchical AMOVA results based on the partial COI sequences of the seven populations of T. granosa

3 討論

3.1 泥蚶COI基因片段核苷酸組成及單倍型分析

在調(diào)查的7個(gè)泥蚶群體的序列中, A+T的平均含量為60.83%, 均大于G+C平均含量(表1), 其他貝類線粒體DNA的堿基組成也具有這種特點(diǎn)(Chen et al,2009; 李詠梅等, 2009; 郭寶英等, 2012)。Grant等(1998)通過對(duì)線粒體DNA序列的遺傳變異分析, 將不同核苷酸多樣性和單倍型多樣性間的組合分成了四種類型: 第一種類型是較低的單倍型多樣性(Hd＜0.5)與較低的核苷酸多樣性(Pi＜0.005), 第二種類型是高Hd值與低Pi值, 第三種類型是低Hd值與高Pi值, 其余為第四種類型。據(jù)此可將北海、海南兩個(gè)群體歸為第四種類型, 而其余群體則為第二種類型。Grant等(1998)認(rèn)為第四種類型是由于一個(gè)大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過長時(shí)間演化所產(chǎn)生或兩個(gè)不同種群二次接觸所造成, 而第二種類型由瓶頸效應(yīng)后伴隨種群的迅速成長與突變的積累形成。泥蚶群體的這種特征可能是由于現(xiàn)階段演化力量(如不同品系泥蚶的引入造成的基因滲透)、生境的不連續(xù)性、種群數(shù)量變動(dòng)的不穩(wěn)定性等因素的影響。

圖2 基于泥蚶26個(gè)COI基因單倍型構(gòu)建的NJ樹Fig.2 The NJ dendrogram based on the sequences of 26 haplotypes of T. granosa

3.2 泥蚶群體的遺傳多樣性

王日昕等(2005)和鄭文娟等(2009)認(rèn)為中國沿海的泥蚶可以分為福建以南和福建以北(包括福建)兩大類群, 后者發(fā)現(xiàn)福建南北群體間的遺傳距離在0.1521—0.1540, 遠(yuǎn)大于類群內(nèi)部群體間的遺傳距離, 且南北兩類群之間的遺傳距離(0.1529)遠(yuǎn)大于類群內(nèi)部遺傳距離(南方類群內(nèi)部遺傳距離為0.0006, 北方類群內(nèi)部的遺傳距離為0.0016), 兩類群的分化程度達(dá)到了亞種甚至種的水平。

Ni等(2012)根據(jù)對(duì)中國東部海域和南海泥蚶類群的COI和ITS1的研究, 提出了兩個(gè)ESUs, 其中一個(gè)ESU廣泛分布中國沿海, 而另一個(gè)則分布在汕頭以南海區(qū)。在本研究以泥蚶26個(gè)單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中, 南方類群中的單倍型Hap2(海南)、Hap11(北海)和Hap12(防城港)形成穩(wěn)定的一個(gè)小支, 聚在了發(fā)育樹的根部, 這和Ni等(2012)提出的一個(gè)ESU相似, 即,均分布在中國南海區(qū)域。

而在本研究中, 南方類群(防城港, 北海, 海南和湛江)遺傳多樣性參數(shù)普遍高于北方類群(榮成, 威海), 而漳州泥蚶群體的遺傳多樣性參數(shù)居中, 表現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異(表3)。南方類群(防城港、北海、海南、湛江)群體間遺傳距離(0.0196—0.0601)、南方群體與北方群體(榮成、威海)的遺傳距離(0.0088—0.0432), 均大于北方群體間的遺傳距離(0.0024—0.0055)。根據(jù)遺傳學(xué)知識(shí)(見 2.2部分), 榮成與防城港、海南、北海分化較弱, 而與威海、湛江、漳州均有極大分化; 福建漳州群體與南方類群(防城港, 北海, 湛江, 海南)以及北方類群(威海, 榮成)的遺傳分化程度均較高(表 5); 南方類群群體間分化較弱, 北方類群群體間有明顯分化, 后者可能是榮成樣本量偏少造成。而對(duì)各群體遺傳分化參數(shù)Fst的AMOVA分析, 發(fā)現(xiàn)泥蚶的遺傳分化主要來自于群體內(nèi)(貢獻(xiàn)率達(dá)90.52)。因此, 泥蚶群體由北向南遺傳多樣性增高, 而群體內(nèi)遺傳分化系數(shù)也呈現(xiàn)升高的趨勢。這可能與 1980年以后每年從北方(主要為山東地區(qū))大量引入南方泥蚶苗種(鄭家聲等, 1995), 以及北部灣地區(qū)復(fù)雜的生活環(huán)境有關(guān)。

圖3 基于泥蚶26個(gè)COI基因單倍型構(gòu)建的UPGMA樹Fig.3 The UPGMA dendrogram based on the sequences of 26 haplotypes of T. granosa

王日昕, 李太武, 呂振明等, 2005. 泥蚶(Tegillarca granosa)不同地理居群同工酶變異及遺傳分化的研究. 海洋與湖沼,36(3): 227—234

尤仲杰, 王一農(nóng), 陳 堅(jiān), 2002. 樂清灣塘養(yǎng)泥蚶的生長. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 26(5): 440—447

李鳳蘭, 1983. 中國近海蚶科的研究, Ⅱ粗飾蚶亞科. 見: 中國貝類學(xué)會(huì). 貝類學(xué)文集-第一輯. 北京: 科學(xué)出版社,40—41

李松偉, 李 曄, 李成華等, 2011. 泥蚶(Tegillarca granosa)精氨酸激酶的基因克隆與表達(dá). 海洋與湖沼, 42(1):119—123

李詠梅, 陳秀荔, 彭 敏等, 2009. 基于線粒體COI基因序列探討廣西欽州灣牡蠣的遺傳分化. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 37(3): 60—65

吳洪喜, 柴雪良, 2004. 浙江樂清灣泥蚶的繁殖習(xí)性和生長特性. 動(dòng)物學(xué)雜志, 39(3): 47—50

張永普, 林志華, 應(yīng)雪萍, 2004. 不同地理種群泥蚶的形態(tài)差異與判別分析. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 28(3): 339—342

鄭文娟, 朱世華, 沈錫權(quán)等, 2009. 基于線粒體 COI基因序列探討泥蚶的遺傳分化. 動(dòng)物學(xué)研究, 30(1): 17—23

鄭家聲, 王梅林, 王志勇等, 1995. 泥蚶的性腺發(fā)育和生殖周期. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 25(4): 503—510

柯佳穎, 陳寅山, 戴聰杰, 2010. 泥蚶血清及血細(xì)胞免疫功能研究. 水生態(tài)學(xué)雜志, 3(3): 80—84

賈守菊, 張永普, 陳艷樂等, 2003. 不同種群泥蚶的 5種同工酶研究. 東海海洋, 21(3): 34—41

徐鳳山, 張素萍, 2008. 中國海產(chǎn)雙殼類圖志. 北京: 科學(xué)出版社, 39

郭寶英, 祁鵬志, 李繼姬等, 2012. 紫貽貝(Mytilus edulis)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析. 海洋與湖沼, 43(1):52—56

溫?fù)P敏, 高如承, 2009. 泥蚶的營養(yǎng)與藥用價(jià)值. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào), 13(3): 168—170, 182

雷煥宗, 林植華, 張永普, 2004. 不同種群泥蚶肉游離氨基酸及無機(jī)元素的含量和組成. 河南科學(xué), 22(2): 203—205

Avise J C, 2000. Phylogeography: the History and Formation of Species. Oxford: Harvard University Press, 1—361

Chen A H, Li Z X, Feng G N, 2009. Phylogenetic relationships of the genus Meretrix (Mollusca: Veneridae) based on mitochondrial COI gene sequences. Zoological Research,30(3): 233—239

Cho E S, Jung C G, Sohn S G et al, 2007. Population genetic structure of the ark shell Scapharca broughtonii Schrenck from Korea, China, and Russia based on COI gene sequences. Marine Biotechnology, 9(2): 203—216

Folmer O, Black M, Hoeh W et al, 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5): 294—299

Grant W S, Bowen B W, 1998. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation. Journal of Heredity, 89(5): 415—426

Kimura M, 1980. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution, 16(2):111—120

Martínez-Navarro E M, Galián J, Serrano J, 2005. Phylogeny and molecular evolution of the tribe Harpalini (Coleoptera,Carabidae) inferred from mitochondrial cytochrome-oxidase I. Molecular Phylogenetics and Evolution, 35(1): 127—146

Matsumoto M, 2003. Phylogenetic analysis of the subclass Pteriomorphia (Bivalvia) from mtDNA COI sequences.Molecular Phylogenetics and Evolution, 27(3): 429—440

Ni G, Li Q, Kong L et al, 2012. Phylogeography of the bivalve Tegillarca granosa in coastal China: implications for management and conservation. Marine Ecology Progress Series, 452: 119—130

Tamura K, Nei M, 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution,10(3): 512—526