陳蘇寧，張 麗，聶品晶，金鐘太

?

中藥益心康對感染CVB3病毒的新生乳鼠體外心肌細胞凋亡及相關因子Bcl-2/Bax表達的影響

陳蘇寧，張 麗，聶品晶，金鐘太

目的 研究中藥益心康對感染柯薩奇病毒嗜心肌毒株3型(Coxsackie virus B，CVB3)新生乳鼠體外心肌細胞凋亡及相關基因Bcl-2/Bax表達的影響，探討中藥益心康治療病毒性心肌炎的作用機制。方法 原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠體外心肌細胞，建立感染CVB3的體外心肌細胞模型，將乳鼠心肌細胞分為4組：正常組、病毒組、益心康組、利巴韋林組。采用倒置顯微鏡觀察心肌細胞生長情況及病變程度(CPE)，用RT-PCR法檢測凋亡相關因子Bcl-2、Bax的表達。結果 益心康組給藥48 h后細胞CPE略輕于利巴韋林。益心康組Bcl-2 mRNA的相對表達量高于病毒組(P<0.01)及利巴韋林組(P<0.05)，而Bax mRNA的相對表達量低于病毒對照組(P<0.01)及利巴韋林組(P<0.05)，且Bcl-2/Bax高于病毒組及利巴韋林組(P<0.05)。結論 中藥益心康能減輕心肌損傷，保護乳鼠心肌細胞，其作用機制與下調(diào)促凋亡基因Bax、上調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2、升高Bcl-2/Bax比值有關。

中藥益心康；柯薩奇病毒；原代細胞培養(yǎng)；Bcl-2/Bax；RT-PCR

0 引言

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是指嗜心肌病毒感染引起的以心肌非特異性間質(zhì)性炎癥為主要病變的心肌炎，是感染性心肌炎最常見的類型。病毒性心肌炎呈全球性分布，發(fā)展中國家居多，各年齡均可發(fā)病，兒童及40歲以下成年人居多。目前發(fā)現(xiàn)30余種病毒可致病，以CVB3最為常見[1]。目前研究證明其發(fā)病機制可能與免疫損傷、炎性細胞浸潤及細胞凋亡等機制密切相關；而細胞凋亡在病毒性心肌炎發(fā)病過程中的地位越來越受到國內(nèi)外學者的重視[2-4]。Bcl-2、Bax是細胞凋亡中重要的調(diào)節(jié)因子[5]，本文采用體外原代心肌細胞培養(yǎng)的方法，應用中藥益心康作用于感染CVB3的SD乳鼠體外心肌細胞模型，探討其對心肌細胞凋亡及凋亡相關因子Bcl-2、Bax表達的影響；并進一步探索中藥益心康抗凋亡作用及治療病毒性心肌炎的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 選用200只1～3 d齡清潔級出生的SD大鼠的乳鼠[6]，雌雄均可，用于心肌細胞原代培養(yǎng)，均購于中國醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.2 實驗病毒 CVB3病毒株為Nancy標準株[7]，購于遼寧中醫(yī)藥大學病毒實驗室。

1.3 益心康藥物組成 人參、黃芪[8]、金銀花、連翹、板藍根、白術、丹參、甘草，中草藥飲片(購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥局)，利巴韋林注射液(華北制藥集團制藥有限公司，購于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院西藥局)。

1.4 主要試劑和儀器 胎牛血清(美國GIBCO 10091-148)；0.25%胰酶-EDTA(美國GIBCO 25200-056)；TRIZOL總RNA提取試劑(Invitrogen 1203406)；RT-PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)BK2701]；倒置顯微鏡(德國來卡 LEITZDMIL)；低速離心機(江蘇金壇800)；生物安全柜美國(NUAIR NU-425-400E)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國NUAIR 4950E)；水浴恒溫振蕩器(江蘇SHA-B)；旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠RE-52A)；電泳槽(北京六一 DDY-Ⅲ)；電泳儀(上海天能EPS-300)；PCR儀(美國PE 9600)；凝膠和圖象處理系統(tǒng)(上海天能GIS-120D)。

2 實驗方法

2.1 益心康藥液的制備 340 g中藥飲片洗滌后混合，加8倍水文火煎煮1 h (金銀花、連翹、板藍根后下)，倒出藥液加6倍水文火煎煮1 h，反復煎煮3次后，混合3次藥液過濾后加入95%乙醇，使藥物含醇量達80%，醇沉后藥液含藥量為1 g/mL，靜置48 h后取上清，高壓滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆?由遼寧中醫(yī)藥大學藥學實驗室提取)[9]。

2.2 細胞生長液配置 由一級胎牛血清、DMEM、青霉素、鏈霉素、Brdu混合組成。

2.3 CBV3病毒制備及測定

2.3.1 CVB3病毒制備 取培養(yǎng)好的HeLa細胞，加入CVB3病毒原液1 mL，培養(yǎng)1 h后，反復清洗3次，加入生長液繼續(xù)培養(yǎng)，待24 h后倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)達到75%～100%即符合要求，反復吹打HeLa細胞并低溫凍融3次，離心過濾后凍存管分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 CVB3半數(shù)組織感染量(TCID50)的測定[7]用Reed-Muench法計算，TCID50為10-3.9，因此，CVB3(Nancy株)的半數(shù)組織感染量(TCID50)約為10-4。

2.4 益心康、利巴韋林對心肌細胞最大無毒劑量測定 將中藥益心康藥液按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024 比例進行稀釋后加入96孔心肌細胞培養(yǎng)板，當藥物最大濃度為1/512時，藥物對心肌細胞未見明顯的細胞毒性，換算可知益心康對乳鼠心肌細胞的最大無毒劑量為1.96 mg/mL；方法同前，利巴韋林最大藥物濃度為1/16時，藥物對細胞未見明顯的細胞毒性，換算可知利巴韋林對乳鼠心肌細胞的最大無毒劑量為6.25 mg/mL。

2.5 乳鼠心肌細胞的制備[10-12]取SD乳鼠200只斷頸處死，無菌條件下開胸取心臟，剪成1 mm3碎塊，加入0.25%%胰酶-EDTA反復消化3次，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化、離心、棄上清，加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液并離心，重復2次后棄上清，加入培養(yǎng)液制成細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，經(jīng)細胞計算器計數(shù)后，放入37 ℃ 5%的二氧化碳培養(yǎng)箱。

2.6 病毒性心肌炎細胞模型的建立[12-15]將培養(yǎng)好的心肌細胞采用隨機分配的方法分成4組：正常組(A組)、病毒組(B組)、益心康組(C組)、利巴韋林組(D組)。分別向已培養(yǎng)48 h的B組、C組、D組中加入病毒液3 mL (病毒毒力為10-4TCID50)，向A組加等量生長液，培養(yǎng)1 h后，棄病毒液并反復清洗3次，分別向A組、B組加入生長液6 mL，向C組中加入益心康中藥液6 mL (濃度為最大無毒劑量)，向D組中加入利巴韋林藥液6 mL (濃度為最大無毒劑量)，繼續(xù)置于5%的CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48 h后倒置顯微鏡下觀察心肌細胞數(shù)量、形態(tài)、貼壁和搏動情況，并更換培養(yǎng)液。

2.7 采用RT-PCR方法檢測感染CVB3心肌細胞中Bcl-2及Bax基因的表達情況

2.7.1 提取總RNA 按照TRIZOL總RNA提取試劑(Invitrogen 1203406)操作，提取體外心肌細胞的總RNA，并于紫外分光光度計測總RNA濃度；測A260 nm/280 nm比率>1.60，RNA純度較好。

2.7.2 反轉錄(Reverse transcription，RT) 取1 μL的總RNA加入已調(diào)制好的20 mL反應液中，混合均勻后按下列條件進行反轉錄反應(PE 9600 PCR儀34號程序)：65 ℃ 1 min，30 ℃ 5 min，15～30 min內(nèi)勻速升到65 ℃ 15～30 min，98 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

2.7.3 聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR) 檢索SD大鼠基因文庫中Bcl-2、Bax 及GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)的cDNA 序列，分別設計其擴增引物(引物合成公司：北京六合華大基因科技有限公司)，如表1。

表1 Bcl-2、Bax及GAPDH引物序列基因

反應體系及反應條件如下。調(diào)制反應液(80 μL)：MgSO46 μL，5*Buffer 16 μL，Taq 0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dH2O 55.5 μL；將20 μL cDNA加入反應液中，輕輕混合；按以下條件進行PCR反應(PE 9600 PCR儀17號程序)：94 ℃預變性3 min，進入PCR循環(huán)，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min。

2.7.4 瓊脂糖凝膠電泳 取反應液10 μL與上樣緩沖液2.5 μL混勻，以含溴乙錠的2%瓊脂糖電泳30 min (電壓為5 V/cm)，紫外分析儀(波長為254、302、366 nm)上觀察電泳條帶，其熒光帶亮度可隨凋亡的程度而變化，檢測目的基因在心肌細胞中mRNA水平的表達峰值。

2.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 心肌細胞形態(tài)學觀察 藥物干預48 h后，倒置顯微鏡下觀察顯示，正常組貼壁生長的心肌細胞形態(tài)呈不規(guī)則的多角形、圓形核位于中央，生長時常彼此交聯(lián)形成單層細胞，呈同步搏動，節(jié)律規(guī)整，頻率約為50～90次/min。病毒組的心肌細胞數(shù)量減少，形態(tài)皺縮脫壁，搏動幅度減小，搏動頻率變快，同步搏動消失；益心康組細胞病變較輕，部分細胞搏動無力，搏動幅度減小，節(jié)律欠規(guī)整；益心康組細胞CPE略輕于利巴韋林組。見圖1～圖4。

圖1 正常組48 h心肌細胞形態(tài)(×200)

圖2 病毒組48 h心肌細胞形態(tài)(×400)

圖3 益心康組48 h心肌細胞形態(tài)(×200)

圖4 利巴韋林組48 h心肌細胞形態(tài)(×200)

3.2 采用RT-PCR法檢測心肌細胞中凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的表達情況 益心康組Bcl-2 mRNA的相對表達量高于病毒組(P<0.01)及利巴韋林組(P<0.05)，而Bax mRNA的相對表達量低于病毒對照組(P<0.01)及利巴韋林組(P<0.05)，且Bcl-2/Bax高于病毒組及利巴韋林組(P<0.05)。見表2、圖5～圖6。

表2 藥物干預對乳鼠心肌細胞Bcl-2及Bax mRNA表達的影響(%)

注：*與正常組比較，P<0.01；#與病毒組、利巴韋林組比較，P<0.05

圖5 PT-PCR法檢測CVB3病毒感染的新生乳鼠體外心肌細胞Bcl-2 mRNA的表達情況

注：1、2為正常對照組，3、4為病毒對照組，5、6為益心康中藥組，7、8為利巴韋林組

圖6 PT-PCR法檢測CVB3病毒感染的新生乳鼠體外心肌細胞Bax mRNA的表達情況

注：1、2為正常對照組，3、4為病毒對照組，5、6為益心康中藥組，7、8為利巴韋林組

4 討論

細胞凋亡(Apoptosis)不同于細胞壞死，是由體內(nèi)外因素觸發(fā)的程序性細胞死亡[16]。凋亡是正常的生理過程，能夠確保正常的生長發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，發(fā)揮積極的防御功能，但凋亡過多或過少均可引起疾病的發(fā)生。該學說在九十年代初才進入研究高潮，近年來已成為醫(yī)學界的關注熱點。而凋亡家族Bcl-2是細胞凋亡中最受重視的基因之一，Bcl-2的過量表達能阻滯多種凋亡誘導因素所引發(fā)的細胞凋亡，具有抗凋亡作用[17]；相反，Bax過量表達可抑制Bcl-2功能而促進細胞凋亡[18]，因而可以認為Bcl-2/Bax值決定了細胞是否發(fā)生凋亡[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，益心康組在感染CVB3的乳鼠心肌細胞中Bcl-2表達增多，明顯高于病毒組與利巴韋林組；而Bax表達減少，明顯低于病毒組與利巴韋林組；Bcl-2/Bax值升高。結果表明，中藥益心康組可抑制心肌細胞中促凋亡基因bax表達，促進抑制凋亡基因Bcl-2表達，增強了感染CVB3乳鼠心肌細胞的抗凋亡作用，且抗心肌細胞凋亡的療效優(yōu)于利巴韋林組。目前西醫(yī)治療此病無特效藥物，一般采用對癥治療，而中藥對于此病的治療取得了良好效果[21]。

中醫(yī)傳統(tǒng)理論認為此病多由外感之邪，侵犯機體，損傷心脈，阻滯氣血，日久耗傷氣陰，益心康由人參、黃芪、金銀花、連翹、板藍根、白術、丹參、甘草等藥物組成以清熱解毒，益氣養(yǎng)陰、活血化瘀。本課題組前期試驗證實了益心康在心肌細胞中抑制CVB3復制、降低TNF-α、TGF-β表達中發(fā)揮重要作用，且對柯薩奇病毒感染心肌細胞具有保護作用[22]，但益心康治療VMC的作用機制尚未完全闡明。細胞凋亡是造成病毒性心肌炎心肌損傷的重要機制，但中藥益心康在治療VMC中的抗細胞凋亡機制尚不清楚，本研究證實了中藥益心康能夠下調(diào)VMC乳鼠心肌細胞中的促凋亡基因Bax，上調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2，升高Bcl-2/Bax，具有減輕心肌損傷、保護心肌細胞的作用，為中藥益心康治療病毒性心肌炎提供了新的理論依據(jù)。

[1] 王吉耀.內(nèi)科學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:338-360.

[2] Kawano H,Okada R,Kauano Y,et al.Apoptosis in acute and chronic myocarditis[J].Jpn Heart J,1994,35:745-750.

[3] Huber SA.Coxsackie virus-induced myocarditis is dependent on distinct immunopathogenic responses in different strains of mice[J].Lab Invest,1997,76:691-701.

[4] Toyozaki T,Hiroe M,Tanaka M.Levels of soluble fas ligand in myocarditis[J].Am J Cardio,1998,82:246-248.

[5] Adams JM,Cory S.The Bcl-2 protein family:arbiters of cell survival[J].Science,1998,281:1322-1326.

[6] 金奇.醫(yī)學分子病毒學[M].北京:高等教育出版社,2001:594.

[7] 劉芳,王雪峰,南春紅,等.黃芩、柴胡對CVB3小鼠心肌炎凋亡及相關基因Bcl2/Bax表達的影響[J].中藥藥理與臨床,2010,26(6):53-56.

[8] 劉唐威,伍偉鋒,馮震博,等.黃芪對小鼠病毒性心肌炎細胞凋亡及bcl-2/bax基因轉錄的影響[J].廣西醫(yī)科大學學報,2003,20(6):823-825.

[9] 張玉梅,張明雪,何偉,等.益氣活血中藥復方與CVB3對乳鼠心肌細胞基因表達的影響[J].中醫(yī)藥導報,2011,17(8):67-69.

[10]Zhang Y,Zhu H,Huang C,et al.Astragaloside IV exerts antiviral effects against coxsackievirus B3 by upregulating interferon-gamma[J].J Cardiovasc Pharmacol,2006,47(2):190-195.

[11]Martherus RS,Zeijlemaker VA,Ayoubi TA.Electrical stimulation of primary neonatal rat ventricular cardiomyocytes using pacemakers[J].Biotechniques,2010,48(1):65-67.

[12]Formigli L,Francini F,Nistri S,et al.Skeletal myoblasts overexpressing relaxin improve differentiation and communication of primary murine cardiomyocyte cell cultures [J].J Mol Cell Cardiol,2009,47(2)334-345.

[13]Shen Y,Xu W,Chu YW,et al.Coxsackievirus group B type 3 infection upregulates expression of monocyte chemoattractant protein 1 in cardiac myocytes,which leads to enhanced migration of mononuclear cells in viral myocarditis[J].J Virol,2004,78(22):12548-12556.

[14]Zhang Y,Zhu H,Ye G,et al.Antiviral effects of sophoridine against coxsackievirus B3 and its pharmacokinetics in rats[J].Life Sci,2006,78(17):1998-2005.

[15]Bugger H,Leippert S,Blum D,et al.Subtractive hybridization for differential gene expression in mechanically unloaded rat heart[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(6):H2714-H2722.

[16]羅永姣,鄧暉,李雙杰,等.黃芪甲甙在Balb/C小鼠CVB3病毒性心肌炎中抗凋亡作用的機制[J].南華大學學報,2010,38(3):328-331.

[17]Hockenbery D,Nunez G,Milliman C,et al.Bcl-2 is an inner mito-chondrial membrane protein that blocks programmed cell death[J].Nature,1990,348:334-336.

[18]Oltvai Z,Milliman C,Schreiber RD,et al.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog.Bax,that accelerates programmed cell death[J].Cell,1993,74:609-619.

[19]Yanagewa B,Spiller OB,Proctor DG,et al.Soluble recombinant coxsakievims and adenovlrus receptor abrogates coxsackievims B3-mediated panereatitis and myocarditls in mice[J].J Infect Dis,2004,189:1431.

[20]Sarastc A,Aroh A,Vuorinen T,et al.Cardiomyceyte apoptosis in experimental cexsankievirus B3 myceardifis[J].Cardiovasc Pathol,2003,12(5):255.

[21]鄭彩慧,韓淑英,吳范武,等.中藥防治CVB3病毒性心肌炎實驗研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(1):184-186.

[22]陳蘇寧,馬麗,高憲新.益心康對感染柯薩奇病毒B3的大鼠體外心肌細胞CVB3mRNA復制及相關細胞因子的影響[J].天津中醫(yī)藥,2011,28(5):410-413.

Effect of yixinkang soup on the apoptosis of cardiomyocytes and the expression of related gene Bcl-2/Bax in the newborn suckling rats infected by CVB3virus

CHEN Su-ning,ZHANG Li,NIE Pin-jing,JIN Zhong-tai

(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To study the effect of yixinkang soup on the apoptosis of cardiomyocytes and the expression of related gene Bcl-2/Bax of newborn suckling rats infected by CVB3virus,and explore the mechanism.Methods The original generation of SD rat cardiomyocytes were cultivated,and CVB3infection cardiomyocyte model was established.The cardiomyocyte were divided into 4 groups:normal group,virus group,yixinkang group and ribavirin group.The apoptosis of cardiomyocytes was observed using flow instrument,and the expression of apoptosis related genes Bcl-2 and Bax was observed by RT-PCR method.Results After 48 h,CPE of yixinkang group was slightly lighter than ribavirin group.The expression of Bcl-2 mRNA in yixinkang group was higher than virus group (P<0.01) and ribavirin group (P<0.05).The expression of Bax mRNA in yixinkang group was lower than virus group (P<0.01) and ribavirin group (P<0.05),and Bcl-2/Bax was higher than virus group and ribavirin group (P<0.05).Conclusion Yixinkang can alleviate myocardial injury,it has protective effects on the rats′ cardiomyocytes.The mechanism of action is related to the down-regulation of Bax,up-regulation of Bcl-2,and the increase of Bcl-2/Bax.

Yixinkang;Coxsackie virus;Primary cell culture;Bcl-2/Bax;RT-PCR

2015-05-28

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110004

沈陽市科學技術計劃項目(F10-205-1-76)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511002