何美琳，張煥容，2＊，王　棟（.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都6004；2.動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都6004）

?

豬戊型肝炎病毒ORF3基因的克隆與原核表達(dá)

何美琳1，張煥容1，2＊，王棟1
（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

摘 要：為了表達(dá)豬源戊型肝炎病毒衣殼蛋白，并對其反應(yīng)原性進(jìn)行研究，采用RT-PCR方法擴(kuò)增豬戊型肝炎病毒（SHEV）ORF3完整基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pMD19-T載體，再亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a （+），構(gòu)建了pET-32a（+）-ORF3表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行篩選，并用SDS-PAGE和免疫印跡等方法分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增到345bp的目的基因片段，表達(dá)載體pET-32a（+）-ORF3轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了ORF3基因編碼的蛋白，當(dāng)IPTG濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6h時(shí)，該基因在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)量最高。表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為29.6ku，與預(yù)期目的蛋白分子質(zhì)量相符。表達(dá)的蛋白既有包涵體形式，也有可溶性形式。經(jīng)Western blot檢測，表達(dá)的目的蛋白能與SHEV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：豬戊型肝炎病毒；ORF3基因；表達(dá)

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）感染引起的經(jīng)腸道傳播的急性病毒性肝炎，主要通過糞便經(jīng)口傳播。人群感染后病死率在0.5%～3%之間，孕婦感染后病情較重，病死率高達(dá)15%～25%。戊型肝炎的暴發(fā)流行主要發(fā)生在亞洲和非洲一些衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國家，散發(fā)病例見于世界各地［1-2］。Meng X J等［3］證實(shí)美國豬群中存在HEV抗體，并檢測到豬HEV RNA，發(fā)現(xiàn)其與人HEV具有極高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，從而首次證實(shí)了HEV種間傳播的可能性。隨后，越來越多的證據(jù)表明豬戊型肝炎是一種人畜共患病，凸現(xiàn)出豬戊型肝炎的公共衛(wèi)生學(xué)意義。目前基因Ⅳ型HEV在我國豬群中普遍流行［4］。臨床上檢測HEV抗體及HEV疫苗的研制多是圍繞ORF2和ORF3而設(shè)計(jì)［5］。由于HEV組織培養(yǎng)困難，難以研制減毒或滅活疫苗，因此，利用基因工程技術(shù)制備重組抗原，研制多肽疫苗成為戊型肝炎研究的熱點(diǎn)［6］。本試驗(yàn)對豬戊型肝炎病毒ORF3基因片段進(jìn)行了克隆及原核表達(dá)，并對其抗原性進(jìn)行了初步鑒定，以期獲得可以作為診斷用的重組蛋白，為進(jìn)一步建立診斷方法提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1含豬HEV核酸的糞便樣品、血清、載體和宿主菌株 含豬Ⅳ型HEV核酸的糞便樣品和陽性血清由愛荷華州立大學(xué)獸醫(yī)診斷與動(dòng)物生產(chǎn)系Tanja教授惠贈(zèng)；2011年-2013年間采自四川地區(qū)20個(gè)規(guī)模化豬場的豬糞便樣品270份，pMD19-T載體為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞、E.coli DH5ɑ、pET-32a（+）和E.coli BL21（DE3）均由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑 Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000和DL 15 000為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；EX-Taq DNA聚合酶、dNTP為TaKaRa公司產(chǎn)品；AXY prepTM DNA膠回收試劑盒、AXY prepTM小量質(zhì)粒提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ為Promega公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的豬戊型肝炎ORF3基因序列（登錄號(hào)：AY594199.1），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，上游引物F1（BamHⅠ）：5′-CGCGGATCCATGGAGATGCCACCATGCGCT-3′，下游引物R1（EcoRⅠ）：5′-CCGGAATTCTCAACGGCGAAGCCCCAGCT-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2病毒RNA的提取與ORF3基因的擴(kuò)增

取豬糞樣懸液，12 000r/min離心5min，取上清液，根據(jù)Invitrogen公司的Trizol說明書提取樣本總RNA。將提取的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA置于-20℃保存。以提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為25μL：cDNA 2.0μL，上、下游引物各1μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，EXTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.15μL，ddH2O調(diào)整總體積至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃10 min，16℃反應(yīng)結(jié)束。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.3PCR產(chǎn)物的純化與克隆 按AXY prepTMDNA膠回收試劑盒說明回收目的片段，并取5μL回收產(chǎn)物經(jīng)20g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測回收效果。將目的片段按照TaKaRa公司的pMD19-T Vector Kit說明進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5ɑ培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性克隆增菌培養(yǎng)后按常規(guī)堿裂解法提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性克隆菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-ORF3。

1.2.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pMD19-T-ORF3質(zhì)粒以及表達(dá)載體pET-32a（+），回收目的片段，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接構(gòu)建重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-ORF3，連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3）。挑選單個(gè)白色菌落接種于含Amp （100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定為陽性者，將菌液按1∶100的比例接種于新鮮的含相同濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至OD 600nm值達(dá)0.6～0.7，取2mL菌液作為誘導(dǎo)前對照，向其余菌液中加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，振蕩培養(yǎng)，分別收取2、4、6、8、10h及過夜誘導(dǎo)菌液各2mL，8 000r/min離心20min，收集菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測 將各時(shí)間點(diǎn)收集的菌體重懸于200μL PBS中吹散混勻，各取20μL分別加入5μL 5×SDS上樣緩沖液，沸水浴5min，取10μL上清于濃度120g/L的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測。電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像保存。

1.2.6重組蛋白表達(dá)形式的鑒定 根據(jù)1.2.5結(jié)果選取表達(dá)量高的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行目的蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)，菌液以8 000r/min離心20min，收集菌體沉淀，用PBS重懸并洗滌2次，菌體重懸于適量PBS，冰浴條件下進(jìn)行。

1.2.7重組ORF3蛋白的純化 配制120g/L的分離膠，向膠板里緩慢加入4mL分離膠，加入1mL的去離子水，待膠凝固后倒掉去離子水，加入4%的濃縮膠200μL，不插梳子，待膠凝固后加入800μL的經(jīng)上樣緩沖液處理過的樣品，另按常規(guī)方法配膠，加入標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白做參考，按常規(guī)方法電泳，電泳結(jié)束后將膠置0.25mol/L的KCl溶液中在脫色，搖床上搖1h，可見在30ku左右位置出現(xiàn)一條白色條帶，將白色條帶切下置蒸餾水中在脫色搖床上搖20min脫去KCL，將切下來的膠研磨碎再加上適量PBS，反復(fù)凍融3次后，8 000r/min離心10min，取上清。

1.2.8重組蛋白的Western blot檢測 取純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的相應(yīng)條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)后的PVDF膜置于50g/L的脫脂奶粉中，4℃封閉過夜，然后轉(zhuǎn)入用TBST按1∶200倍稀釋的豬HEV陽性血清中，37℃溫育2h，用TBST液洗膜3次。再轉(zhuǎn)入用TBST液按1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG中，37℃溫育2h，TBST洗滌液洗膜3次。按照Bio-Rad公司Immun-StarTMWestern C Chemiluminescent Kit說明書顯色，于VersaDoc成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用設(shè)計(jì)的引物從豬糞便樣品中擴(kuò)增出長度約350bp的片段，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

圖1　ORF3基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of ORF3gene

2.2克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，得到與預(yù)期大小一致的載體片段和目的片段，說明豬HEV ORF3基因片段成功插入pMD19-T載體中（圖2）。

圖2　重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.3目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最佳時(shí)間的篩選

重組表達(dá)菌在IPTG濃度1mmol/L時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，不同時(shí)間點(diǎn)收集表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果2、4、6、8、10h和過夜誘導(dǎo)獲得大小約為29.6ku的目的蛋白，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為6h時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最高（圖3）。

圖3　ORF3基因在E.coli BL21（DE3）中的表達(dá)Fig.3 Expression of ORF3gene in E.coliBL21（DE3）

2.4重組蛋白表達(dá)形式的鑒定

超聲破碎離心后的菌體上清和沉淀經(jīng)SDSPAGE檢測顯示，ORF3重組蛋白既以包涵體形式存在，又以可溶性蛋白形式存在（圖4）。

圖4　超聲破碎后ORF3重組蛋白Fig.4 ORF3recombinant protein disintegrated by ultrasonication

2.5ORF3重組蛋白Western blot檢測

Western blot檢測結(jié)果表明，表達(dá)的重組ORF3蛋白能夠與豬HEV陽性血清特異性結(jié)合，在約29.6ku處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期一致（圖5）。說明表達(dá)的重組蛋白可被豬HEV陽性血清識(shí)別，具有良好的抗原性。

圖5　ORF3重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blot analysis of ORF3recombinant protein

3　討論

長期以來，國內(nèi)外對戊型肝炎病毒的研究主要集中在ORF1和ORF2及其編碼蛋白的功能上。但對ORF3的研究表明，ORF3編碼蛋白至少含有4個(gè)線性抗原表位［7］。由于ORF3在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒顆粒裝配和機(jī)體免疫方面可能發(fā)揮重要作用，其蛋白表達(dá)受到更多的關(guān)注。杜麗等［8］分析了pORF3蛋白對于靶細(xì)胞MAPK磷酸化的影響，提出MAPK家族中的p-ERK1和p-ERK2表達(dá)水平的升高與靶細(xì)胞的增殖相關(guān)。Guegan J P等［9］研究表明生長因子可通過MEK1/2-ERK1/2通路的激活促進(jìn)細(xì)胞增殖。王晶晶等［10］研究表明，Ⅳ型ORF3蛋白可抑制TNF-α介導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)移。Dong C等［11］發(fā)現(xiàn)HEV ORF3蛋白能結(jié)合STATl，抑制IFN-α誘導(dǎo)的STATl磷酸化，導(dǎo)致抗病毒基因PKR、2，5-OAS和MxA表達(dá)受到抑制，逃避宿主的攻擊。有學(xué)者認(rèn)為，利用不同型HEV pORF3作診斷試劑，不但可以檢測戊型肝炎病毒基因型，還可以用于診斷急性戊肝［12］。

本研究對Ⅳ型戊型肝炎病毒的ORF3基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對其抗原性進(jìn)行了初步鑒定，旨在獲得可以作為診斷抗原用的重組蛋白。盡管關(guān)于豬戊型肝炎病毒ORF2方面的原核表達(dá)研究相對成熟［13］，但對ORF3相關(guān)蛋白表達(dá)的研究卻不多。本研究成功構(gòu)建了豬HEV原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a（+）-ORF3，當(dāng)IPTG濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6h時(shí)，目的蛋白在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)量最高。誘導(dǎo)表達(dá)后對菌液進(jìn)行超聲破碎，再用SDS-PAGE電泳檢測重組菌裂解上清液和沉淀中融合蛋白的存在形式。結(jié)果表明，目的蛋白在上清液和沉淀中均大量存在，經(jīng)Western blot檢測，表達(dá)的目的蛋白能與豬HEV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。由于該蛋白可以可溶性形式存在，從而避免了包涵體復(fù)性工藝造成的制備成本上升［14］。同時(shí)由于該蛋白也可以包涵體形式存在，避免了表達(dá)菌內(nèi)蛋白水解酶的作用，這會(huì)使最后純化蛋白的難度下降。表達(dá)蛋白良好的抗原性適合作為抗原建立豬戊型肝炎病毒抗體的檢測方法。該重組蛋白為進(jìn)一步建立HEV血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Purdy M A，Carson D，Caustland K A，et al.Viral specificity of hepatitis E virus antigens identified by fluorescent antibody assay using recombinant HEV proteins［J］.J Med Virol，1994，44（2）：212-214.

［2］ Cheng，Y，Du L，Shi Q，et al.Identification of miR-221and-222as important regulators in genotypeⅣswine hepatitis E virus ORF3-expressing HEK 293cells［J］.Virus Genes，2013，47 （1）：49-55.

［3］ Meng X J，Purcell R H，Halbur P G，et al.A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus［J］.Pro Nat Acad Sci USA，1997，94（18）：9860-9865.

［4］ 王鳳陽，李布勇，王 軼，等.?？诤腿齺喌貐^(qū)商品豬中戊型肝炎病毒感染情況調(diào)查［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7（6）：897-897，900.

［5］ 李 斌，蘇乾蓮，趙 武，等.戊型肝炎疫苗研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（6）：154-159.

［6］ 李丹丹，張馨心，于 婧，等.豬戊型肝炎病毒基因ORF2片段克隆及其原核表達(dá)［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009（3）：17-19.

［7］ 張紅梅，戴 星，孟繼鴻，等.戊型肝炎病毒第4基因型中國株ORF2編碼蛋白的抗原表位分析［J］.遺傳，2007（5）：637-642.

［8］ 杜 麗，成 鷹，史巧蕓，等.基因Ⅳ型戊型肝炎病毒ORF3 對HEK293細(xì)胞MAPKs磷酸化的影響［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（4）：46-48.

［9］ Guegan J P，F(xiàn)remin C，Baffet G.The MAPK MEK1/2-ERK1/2pathway and its implication in hepatocyte cell cycle control［J］.Int J Hepatol，2012：328-372.

［10］ 王晶晶，張?jiān)?，田德?戊型肝炎病毒開放讀碼框3蛋白抑制腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)肝細(xì)胞p65的核轉(zhuǎn)移［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2012，22（1）：30-31.

［11］ Dong C，Zafhllah M，Mixson H T，et al.Suppression of interferon-αsignaling by hepatitis E virus［J］.Hepatology，2012，55（5）：1324-1332.

［12］ 竇守強(qiáng)，唐延平，藍(lán)賜華，等.戊型肝炎病毒研究新進(jìn)展［J］.中國獸藥雜志，2007，41（3）：32-34.

［13］ 郝寶成，蘭 喜，胡永浩，等.豬戊型肝炎病毒ORF2部分片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011（10）：214-217.

［14］ 梁煥斌，梁楚敏，古洪浪，等.豬源戊型肝炎病毒ORF3基因的原核表達(dá)及抗原性分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（3）：86-88.

Cloning and Prokaryotic Expression of Swine Hepatitis E Virus ORF3 Gene

HE Mei-lin1，ZHANG Huan-rong1，2，WANG Dong1
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China；2.Key Laboratory of Medicine of Universities in Sichuan，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Abstract：To express recombinant swine hepatitis E virus capsid protein in prokaryotic cells and analyze the reactogenieity of expressed product.The full-length of Swine Hepatitis E Virus（SHEV）ORF3gene was amplified by reverse transcript polymerase chain reaction（RT-PCR）and inserted into vector pMD19-T，then subcloned into prokaryotic expression vector pET-32a（+）.The pET-32a（+）-ORF3was transformed into E.coli BL21（DE3）for expression with the induction of IPTG，at the same time，the time of expression under the induction of IPTG was optimized.The expression product was identified by SDS-PAGE and Western blot.The result showed that the successfully amplified target gene was about 345bp.The protein encoded by ORF3gene was successfully expressed by IPTG induction.The highest expressed protein in E. coli BL21（DE3）was induced with 1mmol/L IPTG for 6h.The relative molecular mass of expressed product was about 29.6ku，consistent with the expected target protein.The expressed protein not only existed in the form of inclusion body but also in the form of soluble protein.Western blot showed that the expressed fusion protein can specifically reacted with SHEV positive serum.

Key words：Swine hepatitis E virus；ORF3gene；expression

作者簡介：何美琳（1990-），女，湖北黃梅人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃（2011JY0034）

收稿日期：2014-12-24

中圖分類號(hào)：S855.3；Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0033-05