王作志，解尚云，劉慶云，魏長宏，卞曉山

250014濟南，武警山東總隊醫(yī)院：1.腫瘤科，2.生物診療中心

負載抗原的DC疫苗聯(lián)合多種T細胞治療非小細胞肺癌的近期療效與不良反應(yīng)

王作志1，解尚云2，劉慶云1，魏長宏1，卞曉山1

250014濟南，武警山東總隊醫(yī)院：1.腫瘤科，2.生物診療中心

非小細胞肺癌治療方法有手術(shù)、放射治療(放療)、化學(xué)藥物治療(化療)三種方式，對機體免疫均有不同程度損傷，而免疫治療通過調(diào)節(jié)機體免疫功能，能夠發(fā)揮防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用[1]。本研究于2011-10至2014-02采用負載抗原的DC疫苗聯(lián)合多種T細胞治療非小細胞肺癌，旨在通過誘導(dǎo)各種功能完善的T細胞，為患者建立全新、健全的免疫體系，并評估其近期療效與不良反應(yīng)。

1對象與方法

1.1對象對非小細胞肺癌24例進行負載抗原的DC疫苗聯(lián)合CIK、γδΤ、NK細胞免疫治療。其中男16例，女8例，年齡41～83歲，平均57.5歲；ECOG評分為0～3分，其中0分1例，1分11例，2分8例，3分4例；肺腺癌14例，肺鱗癌7例，混合型肺癌3例；術(shù)后病理分期為T2～T4，其中Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審查通過，患者本人或其法定代理人知情并同意接受免疫治療。

24例中，年齡較大不能接受手術(shù)和放、化療的患者有4例；多發(fā)轉(zhuǎn)移不能接受手術(shù)，僅接受放、化療單項或者兩項治療的患者有3例；病情較重不能接受或者不愿接受手術(shù)和放、化療的患者有3例；其余都接受手術(shù)治療，并且根據(jù)病情接受放、化療單項或者兩項治療。所有接受放、化療患者在治療結(jié)束2周后進行免疫治療。

1.2主要試劑GM-CSF、IL-4、TNF-a、IL-1α為美國peprothch 產(chǎn)品，CD3mAb為R&D公司產(chǎn)品，IL-2為北京雙鷺生物制藥有限公司產(chǎn)品，異戊烯焦磷(isopentenylpgrophosphate，IPP)購自sigma公司。DC和NK流式：FITC標記CD83、CD86，APC標記CD3，PE標記CD56 BD Accuri C6流式細胞儀測定。CIK流式：PerCP標記CD3，APC標記CD56，BD Accuri C6流式細胞儀測定。

1.3各種細胞擴增方法的建立經(jīng)血細胞分離機(COM.TEC，F(xiàn)resenius Kabi生產(chǎn))機采后分離出患者自體外周血單個核細胞(PBMC)，獲得80 ml PBMC。

1.3.1DC疫苗制備取適量PBMC加入含invitrogen-15的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱溫浴2 h，吸出懸浮細胞。貼壁細胞加入invitrogen-15(含GM-CSF 1000 U/ml， IL-4 20 ng/ml)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天補液，第5天加入自體肺癌細胞裂解物蛋白[2](未進行手術(shù)治療的患者用相應(yīng)的細胞株細胞制備的蛋白替代)致敏DC。第6天加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，第8天收集成熟DC疫苗回輸或凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2CIK細胞擴增方法取適量PBMC，加入含IFN-γ(1000 U/ml)GT-T551培養(yǎng)液，于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24 h后加入終濃度為100 ng/ml 的小鼠抗人CD3單抗、1000 U/ml IL-2，以及100 U/ml IL-1α 繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細胞生長情況，每隔2～3 d補液(含IL-2)，培養(yǎng)12～15 d收集[3]。

1.3.3γδΤ細胞擴增方法取適量PBMC加入終濃度為10 ng/ml IPP、1000 U/ml IL-2 AIM-V培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。每日觀察細胞生長情況，每隔2～3 d補液(含IL-2)，培養(yǎng)10～14 d收集。

1.3.4NK細胞擴增方法取適量PBMC，用NKGM培養(yǎng)體系培養(yǎng)，培養(yǎng)15～20 d收集。

1.4治療方案

1.4.1DC細胞靜脈制劑的制備將洗滌后的(1.2～1.5)×107DC細胞用100 ml生理鹽水重懸，靜脈回輸；DC細胞皮內(nèi)注射制劑的制備：將洗滌后的(1.2～1.5)×107DC重懸在2 ml生理鹽水中，在兩側(cè)免疫部位分12點皮內(nèi)注射，每側(cè)2 ml，免疫部位選擇雙側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)[4]。γδΤ、CIK及NK細胞靜脈制劑的制備：γδΤ、CIK和NK細胞離心洗滌后，將上述細胞(5～8)×109用100 ml生理鹽水重懸，靜脈回輸。

1.4.2輸注方法各種細胞經(jīng)細菌、真菌和支原體檢測及培養(yǎng)，確?；剌敯踩?。檢測合格后制備成制劑。患者接受一療程的治療，采血當(dāng)天記為第0天，DC細胞第8天靜脈輸注、皮內(nèi)注射各1次，第15、22天皮內(nèi)注射各1次；γδΤ細胞第10、11、12天靜脈輸注各1次；CIK細胞第13、14、15天靜脈輸注各1次；NK細胞第16、17天靜脈輸注各1次[5]。所有患者治療后即進入隨訪。

1.5評價指標(1)有可評價病灶的患者臨床療效評定，按照衛(wèi)生部1988年頒布實體瘤客觀療效評定標準進行。對于沒有可評價病灶的患者影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移則為PD。(2)通過檢測24例患者在治療前與治療后2個月外周血CD3+、CD4+、CD56+變化，來評定治療前后的免疫功能的變化。

2結(jié)果

2.1DC、NK和CIK細胞免疫表型培養(yǎng)的DC高表達成熟DC的特異性表面標志CD83，同時也高表達CD86等共刺激分子(圖1AB)，NK細胞表面高表達CD16+、CD56+(圖1C)，CIK細胞表面高表達CD3+、CD56+(圖1D)。

圖1　DC、NK和CIK細胞免疫表型檢測

2.2近期臨床療效隨訪時間為治療后5～18個月，中位時間10個月。22例有可評價病灶的患者中9例PR，11例SD，2例PD；2例沒有可評價病灶的患者中1例PD，1例未見疾病進展。其中1例PR患者情況如下：未接受手術(shù)和放、化療，行一療程免疫治療后，復(fù)查發(fā)現(xiàn)雙肺多個病灶消退或體積減少(圖2)。

圖2　非小細胞肺癌患者CT掃描

2.3免疫學(xué)反應(yīng)結(jié)果治療2個月后，CD3+、CD4+和CD56+均比治療前升高(P<0.01)，CD8+輕微升高(P<0.05)，表明免疫功能在治療之后有了改善(表1)。

表1　治療前、后T淋巴細胞亞群免疫指標變化　(n=24；±s；%)

2.4不良反應(yīng)治療過程中2例輕微發(fā)熱，1例畏寒，均自行消退，沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的不良反應(yīng)。

3討論

細胞免疫治療是除手術(shù)、放療、化療以外的第四種腫瘤治療模式，過繼性免疫治療是腫瘤治療的重要手段。有關(guān)惡性腫瘤患者CD4+T細胞亞群的改變情況報道不一，但多數(shù)研究顯示，CD4+T細胞亞群在惡性腫瘤患者中表現(xiàn)為減少[6-8]。本研究通過流式細胞檢測法分析非小細胞肺癌患者免疫治療后的外周血CD3+、CD4+和CD56+比例，結(jié)果顯示該比例較治療前明顯升高，表明治療后患者免疫功能提高，有利于減緩非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

本研究的策略是，24例中有手術(shù)條件者先進行手術(shù)治療，以降低腫瘤負荷，再根據(jù)患者情況進行放、化療，之后進行生物治療。結(jié)果表明，經(jīng)過負載抗原的DC疫苗聯(lián)合CIK、γδΤ、NK細胞免疫治療后，在22例有可評價病灶的患者中9例達到PR，11例為SD，2例為PD；2例沒有可評價病灶的患者中1例PD，1例未見疾病進展。患者臨床癥狀得以改善，生活質(zhì)量有所提高，治療過程中沒有嚴重的不可耐受的不良反應(yīng)出現(xiàn)，這說明了負載抗原的DC疫苗聯(lián)合多種T細胞治療是安全的。但治療過程中2例輕微的發(fā)熱，1例畏寒，可能是免疫治療后大量的細胞因子釋放引起的。分析免疫功能提高的原因，可能是傳統(tǒng)的放、化療與DC疫苗治療之間有協(xié)同作用，放、化療之后對腫瘤免疫性具有激發(fā)效應(yīng)，且沒有損害免疫效應(yīng)細胞的功能，這為開發(fā)新的化學(xué)免疫治療提供了有力的理論依據(jù)。

目前，國內(nèi)外對于腫瘤患者體內(nèi)T細胞的研究結(jié)果不盡一致[8]，表明T細胞在腫瘤免疫中的作用和地位應(yīng)該從細胞數(shù)量、細胞功能等多方面綜合考慮分析。筆者今后將從多方面、多角度對非小細胞肺癌患者T細胞的免疫功能進行研究，為腫瘤免疫治療提供新的線索和依據(jù)。

【參考文獻】

[1]Schmidt-Wolf G D，Negrin R S，Schmidt-Wolf I G. Activated T cells and cytokine-induced CD3+CD56+killer cells[J].Ann Hematol，1997，74(2)：51- 56.

[2]Jung H K, Yoom L, Yong-Soo B,etal. Phase Ⅰ/Ⅱ study of immunotherapy using autologous tumor Lysate-pulsed dendritic cells in patients with meatastatic renal cell carcinoma[J].Clin Immunol, 2007, 12(5)：257-267.

[3]Hwan Mook Kim, Jaeseung Lim, Song-Kyu Park,etal. Antitumor activity of cytokine-induced killer cell against human lung cancer[J]. Int Immunopharmacol,2007, 24(5)：1802-1807.

[4]Holtl L，Zelle-Rieser C，Gander H，etal. Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysate-pulsedautologous dendritic cells[J]. Clin Cancer Res，2002，8(11)：3369- 3376.

[5]Morse M A，Coleman R E，Akabani G，etal. Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastaticmalignancies[J]. Cancer Res，1999，59(1)：56-58.

[6]Adwani S H,Kutty P M,Copal R,etal. Immunity in oesophageal carcinomal[J].J Surg Oncol，1983，24(4)：268.

[7]Olsen G N,Cangemi J D.Bronchoalveolar layage and the immunologe of primary lung cancer[J].Chest，1985，87(5)：677-683.

[8]Mitropoulos D,Alamanis C,Deliveliotts C,etal.T-lymphocyte subsets in the periphcral blood of patients with renal cell carcinoma[J].Arta Urol Belg，1995，63(3) ：21-25.

(2014-10-15收稿2014-12-05修回)

(責(zé)任編輯尤偉杰)

【摘要】目的評估采用負載抗原的DC疫苗聯(lián)合多種細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(CIK)、γδ受體的T細胞(γδT)和自然殺傷細胞(NK)治療非小細胞肺癌的近期療效與不良反應(yīng)。方法經(jīng)機采后分離出單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，體外經(jīng)相應(yīng)的細胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生DC、γδT、CIK和NK細胞。所有患者接受一療程治療，即靜脈輸注或皮內(nèi)注射4次DC疫苗，靜脈輸注γδT、CIK各3次，靜脈輸注NK細胞2次，共12次治療。通過影像學(xué)檢查及外周血T淋巴細胞亞群改變評估療效和免疫學(xué)反應(yīng)。結(jié)果22例有可評價病灶的患者中9例部分緩解(PR)，11例疾病穩(wěn)定(SD)，2例進展(PD)；2例沒有可評價病灶中1例PD，1例未見疾病進展。與治療前比較，治療2個月后CD3+、CD4+、CD56+有較大升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論負載抗原的DC疫苗聯(lián)合多種T細胞治療非小細胞肺癌有一定的近期臨床療效，能誘導(dǎo)出特異的抗非小細胞肺癌免疫反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】非小細胞肺癌；樹突細胞；自然殺傷細胞；腫瘤裂解物

【中國圖書分類號】R734.2

Efficacy and adverse reactions of antigen-loaded dendritic cell vaccine in combination with various T cells on nonsmall-cell lung cancer

WANG Zuozhi1, XIE Shangyun2, LIU Qingyun1, WEI Changhong1, and BIAN Xiaoshan1. 1. Department of Oncology, 2. Biotherapy Center, Shandong Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014 ,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the clinical efficacy and adverse reaction of antigen-loaded dendritic cells(DC)vaccine in combination with cytokine-induced killer cells(CIK), gamma delta receptors of T cells(γδT)and natural killer cells(NK)on 24 patients with lung cancer. MethodsMononuclear cells isolated by blood apheresis were induced into productions of DC, γδT, CIK and NK cells by corresponding cytokines in vitro. All patients received a course of treatment including intravenous infusion and intradermal injection of DC vaccine for four times, intravenous infusion of γδT, CIK each 3 times and intravenous infusion of NK cells twice, a total of 12 times. Clinical and immunologic responses were evaluated by imaging examination，T lymphocytes subset changes, respectively. Results22 patients were enrolled in this study. During 5-24 months follow-up(median，10 months)，partial remission(PR)in 9 cases，stability of disease(SD) in 11 cases，and progression of disease(PD) in 2 cases was identified with measurable diseases progress. After 2 months treatment，the levels of CD3+、CD4+、CD56+increased very significantly(P<0.001). No severe adverse events were observed except 2 patients with mild fever and 1 patient had muscular soreness. ConclusionsAntigen-pulsed DCs in combination with various T cells shows short-term efficacy on lung cancer through inducing specific antitumor immunity.

【Key words】nonsmall-cell lung cancer；dendritic cells；NK；tumor cell lysate

作者簡介：王作志，本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師,E-mail：wangzuozhi9110@163.com