張　梅, 王宏蘭,張　坤,劉秀財(cái),郭紅艷*,李淑艷

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾161042;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床生化教研室;

3.佳木斯出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 佳木斯154000)

妊娠期糖尿病小鼠表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及其意義

張梅1, 王宏蘭2,張坤3,劉秀財(cái)1,郭紅艷1*,李淑艷

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾161042;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床生化教研室;

3.佳木斯出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 佳木斯154000)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0552)

妊娠期糖尿病( gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期首次發(fā)生和發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常。定義包括了孕前糖尿病和孕期發(fā)生的糖耐量異常[1]。GDM發(fā)病率為1.7%-11.6%[2]。GDM的發(fā)生發(fā)展對(duì)后代會(huì)存在深遠(yuǎn)影響，對(duì)母體則會(huì)造成危害。GDM的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[3,4]。

表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)作為胎盤分泌的重要生長(zhǎng)因子，其與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合進(jìn)而參與著床的調(diào)控，影響胎盤功能，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和分化。目前，有關(guān)于EGF與GDM之間的關(guān)系中，多數(shù)報(bào)道顯示GDM患者血清EGF高于對(duì)照組[6]。本研究旨在觀察GDM小鼠血清及胎盤中EGF的表達(dá)量，以及其與母鼠血糖、新生鼠和胎盤重量之間的關(guān)系，以期探討EGF與GDM之間的因果關(guān)系。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1主要試劑鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma)，EGF ELISA試劑盒(上海凱博生化試劑公司)，兔抗小鼠EGF一抗(RD公司，美國(guó))，兔抗小鼠EGFR一抗(Proteintech Group),GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(基因科技上海有限公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6，6-8周齡，體重18-20 g,雌性，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3主要儀器石蠟切片機(jī)RM2235(Leica)，680型酶標(biāo)儀(Bio-rad),PCR儀(9600型，PE)，高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭TGL-16G)。

1.2　方法

1.2.1GDM小鼠模型建立及分組取C57BL/6小鼠，陰道涂片法確定小鼠動(dòng)情期，按1:2雄雌比例合籠，次晨檢查陰道口及墊料，發(fā)現(xiàn)乳白色栓子記為妊娠第1天，妊娠第6天早晨開(kāi)始禁食12 h后GDM組一次性腹腔注射40 mg/kg 的STZ(STZ溶于0.1 mol/L,pH4.2檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液)，對(duì)照組注射等量緩沖液。注射后第7天測(cè)空腹血糖≥11.1 mmol/L[6]即為造模成功。

1.2.2稱量胎鼠和胎盤重量妊娠第18天每各組母鼠剖腹取胎鼠、胎盤稱重。死亡胎鼠和死亡母鼠的胎鼠、胎盤不計(jì)在內(nèi)。用濾紙吸干胎鼠和胎盤表面液體，稱量。計(jì)算胎盤系數(shù)：胎盤重量/胎鼠重量。

1.2.3ELISA法測(cè)定母鼠血清EGF每組母鼠摘眼球取血，加入肝素鈉，離心得到血清標(biāo)本。按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4RT-PCR測(cè)定胎盤EGF的表達(dá)按Trizol試劑說(shuō)明提取各組胎盤的總RNA，測(cè)定純度和完整性后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由上海生物工程有限公司合成。EGF：(f)5′GTGTTATTGGCTATTCTGAG 3′ (r) 5′GGCTCATCACAAGGGTTCT 3′(214 bp)；β-actin：(f)5′TGCTGTCCCTGTATGCCTCT 3′ (r) 5′GATGTCACGCACGATTTCC 3′(221 bp)。PCR反應(yīng)條件：在95℃ 5 min預(yù)變性，94℃45 s，55℃45 s,72℃ 50 s，33個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物用1.7%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)定量分析。

1.2.5免疫組化測(cè)定胎盤EGF的表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟按兩步法免疫組化試劑盒操作，PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。EGF一抗稀釋濃度1∶150。鏡下觀察小鼠胎盤組織EGF分布及表達(dá)強(qiáng)度，細(xì)胞漿和胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。隨機(jī)抽取每組5只小鼠切片各1張，每張隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野作分析，Image pro-Plus5.1圖像分析軟件進(jìn)行分析，以平均光密度值記錄并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1　胎盤系數(shù)

通過(guò)測(cè)量胎盤及胎鼠重量利用公式計(jì)算，發(fā)現(xiàn)兩組胎盤系數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如表1所示。

±s)

注：※#△與對(duì)照組相比P<0.01

2.2　母鼠血清EGF含量

GDM組母鼠EGF含量為(173.54±3.64)pg/ml,對(duì)照組(135.47±4.98)pg/ml，結(jié)果顯示GDM組血清EGF含量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3　RT-PCR結(jié)果分析

GDM組與對(duì)照組胎盤EGFmRNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如圖1所示。

圖1(A)兩組胎盤EGFR mRNA的表達(dá)。(B)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示GDM組和對(duì)照組比較EGF mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

2.4　免疫組化結(jié)果分析

EGF蛋白經(jīng)過(guò)DAB顯色后呈棕黃色顆粒，表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜，少量表達(dá)在核內(nèi)。兩組小鼠胎盤免疫組化染色經(jīng)圖像分析結(jié)果顯示，GDM組平均光密度為(0.146±0.005)，對(duì)照組為(0.143±0.001)，兩組EGF的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，P>0.05)。

3討論

妊娠期胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞分泌改變被視為GDM發(fā)病的重要基礎(chǔ)[7]。GDM 患者胰島素分泌受限，不足以克服胰島素抵抗而表現(xiàn)為失代償狀態(tài)。有研究表明，EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是胰島β細(xì)胞群擴(kuò)增所必需的[8,9]。本研究發(fā)現(xiàn)GDM組血清EGF水平升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與徐金娥等報(bào)道的一致[10]。推測(cè)GDM患者可能通過(guò)提高血清EGF含量來(lái)擴(kuò)增胰島β細(xì)胞群，從而試圖克服胰島素抵抗。有研究推測(cè)EGF水平的升高是糖尿病相關(guān)性高血糖癥胎兒胎盤的代謝反應(yīng)的結(jié)果[11]。因此，我們認(rèn)為GDM導(dǎo)致了母鼠血清EGF的升高。

圖2　兩組胎盤免疫組化EGF的表達(dá)

妊娠期間EGF與胎兒、胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。EGF和EGFR結(jié)合后，EGFR進(jìn)行自我激活引發(fā)自身磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。本研究應(yīng)用RT-PCR和免疫組化分析胎盤EGF表達(dá),卻發(fā)現(xiàn)GDM組胎盤EGF表達(dá)無(wú)論從mRNA還是蛋白水平上都與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GDM母鼠血清EGF的增高與胎盤EGF的表達(dá)不一致，分析原因可能是胎盤EGF與母體血清EGF來(lái)源不同[12]。

本研究GDM組胎盤重量和胎鼠體重、胎盤效率均高于對(duì)照組(P<0.01)。胎盤系數(shù)是檢測(cè)胎盤功能的指標(biāo)，GDM母體血糖通過(guò)胎盤屏障誘使胎兒的胰腺釋放胰島素，從而造成胎兒高胰島素血癥[13]。胎兒胰島素水平的增加能夠刺激對(duì)胰島素敏感的胎兒組織的有絲分裂和合成代謝機(jī)制，例如肌肉、結(jié)締組織、脂肪組織。我們推測(cè)這些也正是GDM組新生鼠體重、胎盤系數(shù)超過(guò)對(duì)照組的原因。

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摘要：目的探討妊娠期糖尿病小鼠表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)與發(fā)病的關(guān)系。方法采用STZ建立妊娠糖尿病小鼠模型，測(cè)定母鼠血糖、胎盤系數(shù)；ELISA法測(cè)定母鼠血清EGF含量，RT-PCR、免疫組化測(cè)定GDM組和對(duì)照組胎盤EGF的表達(dá)。結(jié)果GDM組胎盤系數(shù)高于對(duì)照組(P<0.01)；GDM組母鼠血清EGF高于對(duì)照組(P<0.01)；而RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示GDM組胎盤EGF表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論GDM導(dǎo)致血清EGF發(fā)生變化，而EGF并非GDM發(fā)病的原因。

關(guān)鍵詞：妊娠期糖尿病；表皮生長(zhǎng)因子；表皮生長(zhǎng)因子受體

Expression of EGF in GDM mice and its SignificanceZHANGMei，WANGHong-lan，ZHANGKun,etal.(DepartmentofBiochemistry,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161042,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relationship between expression of EGF in gestational diabetes mellitus (GDM)mice and GDM.MethodsSTZ was used to induce GDM in mice,mother mice blood glucose were obtained.The weight of neonatal mouse and placenta were determined immediately after birth.EGF were tested with ELISA in mothers serum.Expression of EGF in placenta were measured by RT-PCR and IHC.ResultsThe weight of neonatal mouse and placenta,placental coefficient of GDM mice was higher than control group(P<0.01)；serum EGF in GDM mice was higher than control group (P<0.01),but the expression of EGF in placenta have no different between GDM and control mice(P>0.05).ConclusionGDM is the reason of change of serum EGF,but it’s not pathogenetic factors of GDM.

Key words:gestational diabetes mellitus;epidermal growth factor;epidermal growth factor receptor

收稿日期：(2014-05-06)

作者簡(jiǎn)介：張梅,38歲，女，講師，碩士研究生，研究方向：基因藥物的靶向治療。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R587.1

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0552-03

通訊作者*

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12521643)