馬麗，魏海霞，汪倩倩，后來旺，張宗舟*

（天水師范學院生物工程與技術學院，甘肅天水741001）

航天誘變毛霉ZY-3在腐乳生產中的應用研究

馬麗，魏海霞，汪倩倩，后來旺，張宗舟*

（天水師范學院生物工程與技術學院，甘肅天水741001）

航天誘變毛霉（Mucor）ZY-3菌株是一株能夠耐高溫的菌株，產酶適宜溫度較高，在38～42℃的條件下ZY-3的生長狀況最好，蛋白酶活性達到較高范圍。用ZY-3代替原始高大毛霉（Mucor mucedo）菌種接種豆腐坯，結果表明，腐乳發(fā)酵階段抗污染力強、長勢好，成品滋味鮮美。毛霉ZY-3生產的腐乳符合商業(yè)標準SB/T 10170—2007《腐乳》的要求，以顏色、風味、特色、固形物含量等作為影響論域的主要因素，進行了產品的模糊綜合評價，證明毛霉ZY-3菌株可以用于腐乳生產。

航天誘變；毛霉ZY-3；腐乳；模糊評價

腐乳是用豆?jié){的凝乳狀物制成豆坯，再經微生物發(fā)酵制得的干酪型產品[1]，在中國歷史悠久，北魏時期已有記載，但一直以來沒有被重視，直到20世紀50年代之前還處于“傳統(tǒng)自然發(fā)酵時期”，60年代后才有所緩慢發(fā)展[2]。腐乳逐漸成為滋養(yǎng)食品及重要調味品[3-4]，其作為一種有效提升大豆效價的發(fā)酵豆制品，日益引起了國內外廣大消費者、食品衛(wèi)生及工業(yè)生產部門的廣泛關注。但目前我國的腐乳生產仍不甚理想，生產工藝與設備技術都比較落后，僅實現了部分現代機械化，后期生產工藝仍相對落后，產品質量不穩(wěn)定，生產企業(yè)各種認證未能與世界接軌[5]。

為了獲得更佳口味與營養(yǎng)的腐乳產品[6]，將一株高大毛霉野生種通過神舟六號航天搭載，得到較為理想的突變菌種—ZY-3。并用航天誘變毛霉ZY-3對腐乳生產工藝做了改進[7]，力求最大程度的完善提高腐乳產品質量，并對最終獲得的符合國家衛(wèi)生標準、理化指標和感官標準的腐乳產品，借助模糊數學，構建模型將一些不易明確定量的因素進行綜合評價[8-9]，旨在將毛霉ZY-3菌株用于腐乳生產，提高產品質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

豆腐、食鹽、復合香辛料、辣椒粉、白酒（52度）、黃酒（15度）：市售；樣品1#為市售老才臣腐乳成品；樣品2#腐乳是航天誘變毛霉ZY-3制得；樣品3#腐乳為市售王致和腐乳成品；樣品4#是用高大毛霉野生種發(fā)酵制得的腐乳。

1.1.2 菌種

高大毛霉野生種（Mucor mucedo）、航天誘變毛霉（Mucor）ZY-3：天水師范學院微生物實驗室保藏；紅曲（Monascus purpureus）：浙江三禾生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g，蔗糖10 g，瓊脂10 g，水500 mL。馬鈴薯去皮切塊，煮沸30 min后用紗布過濾，取濾液加入糖和瓊脂，溶化后補足水至500 mL，121℃滅菌25 min即可[10]。

1.1.4 化學試劑

乳酸、磷酸、硼酸均為分析純：上海微譜化工技術有限公司；Na2CO3（分析純）：廊坊鵬彩精細有限公司；三氯醋酸、NaOH、酪素均為分析純：青島雅格化學試劑銷售有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP系列電熱恒溫培養(yǎng)箱：常州市萬合儀器制造有限公司；AB204-N型號分析天平：上海精密科學儀器有限公司；MJ-78A滅菌鍋：杭州舟倍科技有限公司；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋：黃驊市渤海電器廠；722型分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；PHS-2C型精密酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的擴大培養(yǎng)

ZY-3擴大培養(yǎng)：麩皮，加入適量的水和磷酸二氫鉀0.5%，溶液與麩皮按1∶1混合，麩皮含水量基本達到49%，裝入菌種瓶中，121℃滅菌25 min，取出搖散、接種，35℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 制曲

米粉與水1∶1混合，要求含水量50%左右，至于淺盤中滅菌，淺盤內米粉的厚度1.5 cm，接入擴大后的ZY-3毛霉菌種，培養(yǎng)至表面長滿菌絲后翻動一次最終淺盤中的米粉全部由白色毛霉菌絲覆蓋，此時大曲已長好，晾曬干燥后粉碎，低溫密封儲藏，制曲完成。

1.3.3 ZY-3誘變毛霉蛋白酶活性的測定

蛋白酶活性的測定采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林法進行[11]。

蛋白酶活力的定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5）條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位（U/g）。

1.3.4 腐乳（紅方）的生產工藝流程及操作要點

操作要點：

前期發(fā)酵：將豆腐均勻切成3.0 cm×3.0 cm×1.5 cm的豆腐坯，入蒸鍋蒸20 min，取出冷卻至35℃后放入蒸籠格盤中，豆坯間隔1 cm撒上制好的曲完成接種[12]，3～4 d豆坯整個被白色的毛霉包裹，期間需要翻格2次，豆坯長好后將稍作晾曬，散去霉味。

裹料：將12%鹽、辣椒、花椒、八角茴香等香料拌勻，加入少量紅曲粉；取初次發(fā)酵的腐乳先均勻蘸上黃酒再裹上準備好的香料。

后期發(fā)酵：裹好料的腐乳塊整齊裝入發(fā)酵壇中，裝好后倒入少量白酒并撒一層拌好的料對上層腐乳進行封面，上層料中適當增加食鹽含量達到抑制雜菌的目的[12]，密封壇口，發(fā)酵60 d腐乳完全成熟。

1.3.5 產品質量指標測定

腐乳發(fā)酵完成后按照商業(yè)標準SB/T 10170—2007《腐乳》、GB 2712—2003《發(fā)酵豆性制品衛(wèi)生標準》及GB/T 4789.232—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗冷食菜、豆制品檢驗》進行感官指標、理化指標及微生物指標測定。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對毛霉ZY-3蛋白酶活性的影響

蛋白酶的活性決定了產品的風味和營養(yǎng)品質等，通常蛋白酶有酸性、中性和堿性蛋白酶，而中性蛋白酶是3種酶中較重要的一種。在不同溫度條件下測量了航天誘變毛霉ZY-3中3種蛋白酶的活性，結果見圖1。

由圖1可知，40℃之前隨溫度上升蛋白酶活性增加，尤其對中性蛋白酶效應明顯，而在40℃的基礎上再升溫，酶活性反而下降，這說明航天誘變毛霉ZY-3蛋白酶活在40℃時最高，在生產中適宜于腐乳的發(fā)酵溫度應控制在38～42℃。

2.2 食鹽添加量對毛霉ZY-3蛋白酶活性的影響

由圖2可知，培養(yǎng)物的含鹽量在10%時雖然蛋白酶活最高，但此時其他雜菌的侵染不能被有效抑制，尤其是不能抑制野生酵母的生長；適當增加鹽含量，當鹽分為12%時雜菌明顯減少而蛋白酶活稍有抑制但抑制雜菌較理想[13]，所以綜合多個因素考慮腐乳生產中加鹽量應控制在12%為宜。

2.3 產品質量評價

按商業(yè)標準SB/T 10170—2007《腐乳》中規(guī)定，產品紅方應具有的感官特征，表面呈鮮紅色或棗紅色，斷面呈杏黃色；滋味鮮美，咸淡適口，具有紅腐乳特有氣味，無異味；質地細膩，塊形整齊，無雜物[7]。產品的理化及微生物指標見表1。

由表1可知，2#產品即航天誘變毛霉ZY-3菌株參與發(fā)酵制得的腐乳，其氨基酸態(tài)氮、水溶性蛋白質的含量都高于其他幾個樣品，凸顯了ZY-3菌株用于生產腐乳時在營養(yǎng)、質量、生產效率中的優(yōu)勢；其中ZY-3型腐乳的水溶性蛋白質含量分別高出老才臣和王致和產品1.16 g/100 g、1.75 g/100 g，這說明誘變毛霉ZY-3菌株的蛋白質降解能力強，發(fā)酵過程中腐乳成熟速度快，對于生產者來說產品風味和營養(yǎng)不受影響的情況下意味著綜合效益有所提高。

2.4 對ZY-3型腐乳的質量綜合評價

技術人員10人組成評價小組，對4個產品進行投票，利用模糊綜合評價模型對航天誘變毛霉ZY-3參與發(fā)酵制得的紅腐乳與其他幾個產品進行全面的質量評價。

2.4.1 構建模糊評價模型

影響因素的集合組成論域U=｛顏色，味道，塊形，質地，固形物含量，特色｝；設計因素的評價等級I=｛i1，i2，i3，i4，i5｝，分別表示產品在各個影響因素的等級為特級、高級、一級、二級、合格。即I集合是對論域U中的各元素如顏色、塊形、質地細膩度、味道和固形物含量等的復合關系。各個影響因素權重的集合，即為權重矩陣M=｛m1，m2，m3，m4，m5，m6｝由評價小組人員參考SB/T 10170—2007《腐乳》行業(yè)標準決定權重比例[14-15]。該實驗中確定因素權重矩陣M=｛0.1，0.2，0.15，0.2，0.25｝。

2.4.2 對投票數據的處理和分析

對于某同類產品1、2、3…，定義矩陣C為模糊關系矩陣；其中Cij≥0任意i、j，j=1、2…n。Cij表示某產品的第j個影響因素在評判小組成員的評判下基本屬于等級i的范疇，即Cij作為評判人員對第j個影響因素在i等級下的評判關系系數。

考慮所有因素的綜合影響，定義最終模糊綜合評價參數的矩陣為Dx=M×Cm（其中m為不同產品），最終評價總分P=Dx·In（n為某一影響因素對應的不同評價等級的賦值）。

D1=M×C1

d11=0.02+0.06+0.01+0.045+0.14+0.1=0.375，同理d12= 0.44，d13=0.155，d14=0.03，d15=0，d16=0。所以，根據上式運算得D1=｛0.375，0.44，0.155，0.03，0｝同一個產品所有因素的模糊綜合評價參數之和為1，即0.375+0.44+0.155+0.03=1。按評價等級從高到低分別賦于分值5、4、3、2、1則，1#產品最終得分P1=0.375×5+0.44×4+0.155×3+0.03×2=4.16分。同理將所有樣品投票分值結果見表2。

通過上述模糊綜合評價后可以得出結論，對于不同的幾種腐乳產品1#、2#、3#、4#的總分排名次序為2#＞1#＞3#＞4#，這說明經過模糊綜合評價，航天誘變毛霉ZY-3菌株生產的腐乳產品各方面都優(yōu)于高大毛霉野生種生產的腐乳，而且質量指標也優(yōu)于部分市售腐乳。

3 結論

隨著市場競爭和消費者要求的不斷提升，腐乳生產者需要不斷改進生產工藝，菌種改良是整個生產工藝的關鍵，腐乳的發(fā)酵程度、風味特色、成本都與菌種關系密切；本實驗中利用航空搭載，選育出高大毛霉誘變種，ZY-3號毛霉，它從蛋白酶活、耐高溫、抗污染等內在因素及菌絲的長勢、長度、潔白程度等外觀因素來說都是一株優(yōu)良菌種。

對航天誘變毛霉ZY-3進行腐乳發(fā)酵測試，與市售腐乳對比發(fā)現，ZY-3型腐乳的氨基酸態(tài)氮和水溶性蛋白質含量都高于市售產品，且腐乳顏色純正，表面無雜物，風味突出。進一步通過構建模糊綜合評價模型對ZY-3腐乳產品的感官指標和理化指標綜合分析，結果顯示，ZY-3型腐乳質量綜合分值較高，并滿足相關標準要求。

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MA Li,WEI Haixia,WANG Qianqian,HOU Laiwang,ZHANG Zongzhou*
(College of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui 741001,China)

MucorZY-3 is a space mutation strain with high temperature resistance,and it is suitable in high temperature for enzyme production.The optimal growth temperature for strain ZY-3 growth was 38-42℃,and the protease activity reached a high range.Tofu pehtze was inoculated with strain ZY-3 instead of the originalM.mucedo,and the results showed that sufu showed strong anti-pollution ability,good growth and delicious taste.Several kinds of sufu fermented by strain ZY-3 conforming to SB/T 10170—2007 were evaluated by fuzzy comprehensive evaluation,using color,flavor, characteristics,and solid content as main evaluation factors.It was proved that strain ZY-3 could be used in the production of sufu.

space mutation;MucorZY-3;sufu;fuzzy evaluation

Q933

A

0254-5071（2015）04-0062-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.014

2015-03-11

2010甘肅省自然科學基金項目（1010RJZE029）

馬麗（1992-），女，本科生，研究方向為應用微生物。

*通訊作者：張宗舟（1957-），男，教授，博士，研究方向為應用微生物。