龍 兵，羅 楊，門 放

（1.四川警察學(xué)院 四川瀘州 646000；2.瀘州市公安局 四川瀘州 646000）

混合血樣DNA等位基因分型探究

龍 兵1，羅 楊2，門 放1

（1.四川警察學(xué)院 四川瀘州 646000；2.瀘州市公安局 四川瀘州 646000）

以人體混合血樣為研究對(duì)象，研究?jī)蓚€(gè)體混合血樣的基因座等位基因分型表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)材料與方法∶采用Chelex-100法提取DNA，ID試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，AB-3130基因自動(dòng)分析儀電泳，Genemapper3.2軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果∶兩個(gè)體混合血樣的基因座等位基因可表現(xiàn)為4個(gè)等位基因，3個(gè)等位基因，2個(gè)等位基因或1個(gè)等位基因。隨著混合比例差距的增大，量少個(gè)體的等位基因峰相對(duì)于量多個(gè)體等位基因峰越來(lái)越低。當(dāng)混合比例達(dá)到1∶10時(shí)，量少個(gè)體的等位基因峰很低，基本上不影響量多個(gè)體的等位基因分型。

混合樣本；DNA；STR；等位基因

DNA分析已經(jīng)成為公安工作中進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的重要技術(shù)，在案件的偵破和審判中發(fā)揮重要作用。對(duì)于一些特殊檢材的分析，比如混合樣本的分析就是目前DNA分析的一個(gè)難點(diǎn)[1][2]?；旌蠙z材是指被測(cè)樣本來(lái)自兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)體,常見于陰道拭子、乳頭拭子、皮膚咬痕、致傷多人的兇器、指甲等[3]，是檢案中經(jīng)常遇到的檢材。對(duì)于此類檢材，我們常感到十分棘手，難以進(jìn)行確切的個(gè)體識(shí)別，嚴(yán)重影響此類案件的偵破和審判[4]。本文主要討論了兩個(gè)體混合血樣的基因座等位基因分型表現(xiàn)。

一、材料與方法

（一）樣本及DNA提取。

采取4名個(gè)體靜脈血樣，標(biāo)記為1，2，3，4號(hào)個(gè)體。將1號(hào)個(gè)體與2號(hào)個(gè)體血樣分別按照1:1，1: 2，1:10，1:50體積混合；3號(hào)與4號(hào)個(gè)體血樣按照同樣方法進(jìn)行混合。對(duì)所用檢測(cè)樣本均采用Chelex-100法提取DNA[5]，提取的血量為8ul。

（二）PCR擴(kuò)增。

采用AB公司ID試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10ul。AB公司9700 PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性11min，94℃變性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，60℃保溫60min。

（三）電泳檢測(cè)及分析。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用AB公司3130基因自動(dòng)分析儀電泳，Genemapper3.2軟件進(jìn)行分析。電泳體系為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1ul，去離子甲酰胺10ul,GS500LIZ內(nèi)標(biāo)1.25ul。

二、結(jié)果

當(dāng)按照1：1體積進(jìn)行混合時(shí)，DNA圖譜中兩名個(gè)體的等位基因峰高比較均衡,如圖1(1號(hào)、2號(hào)個(gè)體STR分型結(jié)果見表1、表2)。當(dāng)混合體積為1：2時(shí)，量少個(gè)體等位基因峰高比較明顯低于量多個(gè)體。隨著混合比例的增大，量少個(gè)體等位基因峰相對(duì)于量多個(gè)體等位基因峰越來(lái)越低。當(dāng)混合比例達(dá)到1：10時(shí)，量少個(gè)體等位基因峰很低，基本上不影響量多個(gè)體的等位基因分型（如圖2）。兩個(gè)體混合樣本等位基因可表現(xiàn)為4個(gè)等位基因（如圖3），3個(gè)等位基因（如圖4、5），2個(gè)等位基因（如圖6）或1個(gè)等位基因（如圖7）。

表一 1號(hào)個(gè)體STR分型結(jié)果

表二 2號(hào)個(gè)體STR分型結(jié)果

圖一 1號(hào)與2號(hào)個(gè)體1：1體積混合血樣STR分型圖譜

圖二 1號(hào)與2號(hào)個(gè)體1：10體積混合血樣STR分型圖譜

圖三 1號(hào)與2號(hào)個(gè)體混合樣本D8S1179基因座分型結(jié)果

圖四 1號(hào)與2號(hào)個(gè)體混合樣本TH01基因座分型結(jié)果

圖五 1號(hào)與2號(hào)個(gè)體混合樣本D3S317基因座分型結(jié)果

圖六 1號(hào)與2號(hào)個(gè)體混合樣本D3S1358基因座分型結(jié)果

圖七 1號(hào)與2號(hào)個(gè)體混合樣本TPOX基因座分型為8

三、討論

混合樣本檢測(cè)是法醫(yī)DNA分析的難點(diǎn)。尤其是隨著混合個(gè)體的數(shù)量的增加，分析顯得尤為困難。本實(shí)驗(yàn)探討了兩個(gè)體混合樣本的STR基因座等位基因分型圖譜。兩樣本混合STR圖譜與該兩個(gè)個(gè)體STR等位基因基因型情況密切相關(guān)。人體細(xì)胞核DNA為二倍體，一名個(gè)體STR等位基因最多為兩種（雜合子為兩個(gè)不同的等位基因，純合子為兩個(gè)相同的等位基因）。兩個(gè)體混合樣本的單個(gè)STR分型可能表現(xiàn)為四種情況：4個(gè)等位基因，3個(gè)等位基因，2個(gè)等位基因，1個(gè)等位基因。本次研究的1號(hào)與2號(hào)個(gè)體混合血樣DNA分析的D8S1179、D21S11基因座表現(xiàn)為4個(gè)等位基因（1號(hào)、2號(hào)個(gè)體STR分型結(jié)果見表1、表2）；TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、D18S51、FGA基因座表現(xiàn)為3個(gè)等位基因；D7S820、CSF1PO、D3S1358、D5S818基因座表現(xiàn)為2個(gè)等位基因；TPOX基因座表現(xiàn)為1個(gè)等位基因。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為4個(gè)等位基因時(shí)，兩名個(gè)體均為雜合子，如果我們已知一名個(gè)體的分型，容易推斷另外一名個(gè)體的分型，當(dāng)混合比例達(dá)到1：10時(shí)，我們從圖譜上能夠比較容易區(qū)分兩名個(gè)體的基因座等位基因分型，如本次研究的D8S1179基因座（如圖3），1號(hào)個(gè)體基因型為13-15，2號(hào)個(gè)體基因型為10-14，從1：10混合血樣圖譜上我們能夠清晰的進(jìn)行區(qū)分。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為3個(gè)等位基因時(shí)，個(gè)體的等位基因組合就比較多，兩名個(gè)體可能一名為純合子，一名為雜合子，也可能兩名個(gè)體均為雜合子，如本次研究的TH01基因座一名個(gè)體為純合子（9-9），一名個(gè)體為雜合子（6-7），當(dāng)混合比例達(dá)到1：10時(shí)，含量少的個(gè)體（9-9）分型峰很低（如圖4）。混合樣本D13S317基因座分型圖譜表現(xiàn)為3個(gè)等位基因，兩名個(gè)體均為純合子（10-11，11-12），隨著混合比例的增加，等位基因10的相對(duì)峰高逐漸降低（如圖5）。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為2個(gè)等位基因時(shí)，兩名個(gè)體可能都為純合子，可能一個(gè)純合子與一個(gè)雜合子，可能兩個(gè)都為雜合子。如本次研究的D3S1358基因座一名個(gè)體為雜合子（15-16）另一名個(gè)體為純合子（16-16），隨著混合比例的增加，等位基因15的相對(duì)峰高逐漸降低（如圖6）。

當(dāng)混合樣本DNA分析基因座表現(xiàn)為1個(gè)等位基因時(shí)，則兩名個(gè)體為相同的純合子，如本次研究的TPOX基因座兩名個(gè)體均為純合子（8-8）（如圖7）。

混合樣本是法醫(yī)DNA分析的一個(gè)難點(diǎn)問題，我們只是對(duì)兩樣本混合的情況進(jìn)行了等位基因分型的初步研究，如何區(qū)分混合樣本中各個(gè)個(gè)體的基因型將是一個(gè)長(zhǎng)期研究的課題。

[參考文獻(xiàn)]：

[1]呂德堅(jiān)，陸惠玲，陳玉川.混合斑的DNA分型解析[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（3）:185-188.

[2]Bill,P.Gill,J.Curran,T.Clayton,R.Pinchin,M.Healy,J.Buckleton,PENDULUM-a guideline based approach to the interpretation of STR m ixtures,Forensic Sci.Int.148(2004)181-189.

[3][美]布爾特爾.法醫(yī)DNA分型∶STR遺傳標(biāo)記的生物學(xué),方法學(xué)及遺傳學(xué)[M].侯一平.劉雅誠(chéng)譯，北京∶科學(xué)出版社，2007.

[4]T.M.C layton,J.P.W hitaker,R.L.Sparkes,P.Gill,Analysis and intepretation ofm ixed forensic stains using DNA STR profiling,Forensic Sci.Int.91(1998)55-70.

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Exp loration on Allelic Classification of Mixed Blood DNA

LONG Bin,LUO Yang,MENG Fang

Target:Research on allelic classification performance of gene locus in two mixed human blood.Materials and Methods:using Chelex-100 to extract DNA,amplifying PCR in ID kit,making analysis by AB-3130 gene electrophoresis automatic analyzer and Genemapper3.2 software.Results:4 or 3 or 2 or 1 alleles can be showed in twomixed blood gene locus.With the increasing ofmixture ratio,the allele peak with less amounts becomes lower and lower than those with more amounts.When mixing proportion reaches 1:10,allele peak is lowest,basically does notaffectallelic classification in large amounts

Mixed Samples;DNA;STR;Allele

D919.2

：A

：1674-5612（2015）01-0051-06

（責(zé)任編輯：吳良培）

2014-07-11

龍 兵，(1980-)，男，四川德陽(yáng)人，四川警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系副教授，研究方向：法醫(yī)遺傳學(xué)。