龔 強(qiáng)， 丁 利， 肖家勇， 徐麗廣， 羅斯斯，焦艷娜， 朱紹華， 文江為， 付善良， 王利兵*

（1.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；3.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

雙酚 A（BPA），一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對(duì)哺乳動(dòng)物和水生動(dòng)物的生殖發(fā)育會(huì)造成不同程度的影響，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康產(chǎn)生極大的危害。作為一種廣泛應(yīng)用于塑料制造的化學(xué)物質(zhì)，食品接觸材料中含有BPA，可滲透、遷移進(jìn)入到食品，對(duì)人類(lèi)健康造成不容忽視的危害。多個(gè)國(guó)家已對(duì)食品接觸材料中雙酚A的遷移量提出相關(guān)限量要求。因此食品接觸材料中BPA遷移的痕量測(cè)定已成為各國(guó)食品安全檢測(cè)的新熱點(diǎn)[1-3]。

PCR技術(shù)以快速、簡(jiǎn)便、特異、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，已被越來(lái)越多地應(yīng)用于核酸探針的制備和生物樣品的檢測(cè)。1992年 Sano[4]等首次將 PCR技術(shù)引入免疫反應(yīng)，把抗原抗體反應(yīng)的強(qiáng)特異性與PCR技術(shù)的高敏感性、強(qiáng)擴(kuò)增能力結(jié)合在一起，開(kāi)發(fā)了免疫-PCR 技 術(shù) （immuno polymerase chain reaction，IPCR）。利用樣品中檢測(cè)目標(biāo)物與PCR反應(yīng)管中包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體分子，進(jìn)而PCR擴(kuò)增與抗體分子偶聯(lián)的探針DNA分子，通過(guò)Ct值作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。已有報(bào)道表明，該方法在醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的研究取得了很好的成果[5-9]，但采用此方法進(jìn)行小分子的檢測(cè)相關(guān)報(bào)道還較少。

目前，對(duì)于BPA的遷移分析檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法 （HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）等[10-13]。 本實(shí)驗(yàn)基于免疫PCR原理，建立了食品接觸材料中雙酚A在食品模擬物中遷移量的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫PCR檢測(cè)方法，與前幾類(lèi)方法相比較，前處理簡(jiǎn)單、可以批量檢測(cè)。本方法檢測(cè)低限為3.0 fg/g，方法快速、靈敏，適用于食品接觸材料中雙酚A及其他小分子化學(xué)物的痕量遷移檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 4-（N-馬來(lái)酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽 （Sulfo-SMCC，Sigma-Aldrich），PBS，NaCl，EDTA，戊二醛，吐溫-20，牛血清白蛋白質(zhì)（BSA），BPA（Sigma-Aldrich），PBS 緩沖液（pH 7.4），超純水，乙酸，乙醇，BPA 多克隆抗體，均由江南大學(xué)食品安全科學(xué)研究所提供；超濾管，Millipore 公司產(chǎn)品；SYBR?Premix EX TaqTMⅡ熒光PCR試劑盒，Takara公司產(chǎn)品。

1.1.2 DNA分子 Takara合成。上游引物：5’-GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT-3’；下游引物：5’-GCCGAAAAATCTGGAAGGTC-3’；5’端巰基修飾探針（89bp ssDNA）：5’-SH-GGGAAAATGC AAG AAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATA ACGT GAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAG A TTTTTCGGC-3’。

1.2 儀器

PRISM 7000型熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司制造 ；SA300 型 Shaker，Yamato 公司制造；THERMO Star微孔板振蕩器，德國(guó)BMG LABTECH公司制造；Centrifuge離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司制造。

1.3 方法

1.3.1 DNA-BPA抗體偶聯(lián)物的制備 2.5 mg雙異功能團(tuán)偶聯(lián)劑Sulfo-SMCC溶解于1 mL超純水，取10 μL 溶于 980 μL PBS 緩沖液 （含 150 mmol/L NaCl）中，加入 10 μL 96 μg/mL BPA 抗體溶液，室溫振蕩反應(yīng)30 min，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 k的超濾管對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行超濾（5 000 r/min，水平轉(zhuǎn)子，離心50 min），除去多余的偶聯(lián)劑。截留物用990 μL PBS 緩沖液（含 5 mmol/L EDTA）復(fù)溶，加入10 μL 1.0 μmol/L ssDNA，室溫振蕩反應(yīng) 30 min，反應(yīng)混合物用截留相對(duì)分子質(zhì)量30 k的超濾管進(jìn)行超濾，除去未結(jié)合的DNA。截留物再用1 mL PBS（含5 mmol/L EDTA）溶解，溶解產(chǎn)物即為DNABPA抗體偶聯(lián)物。

1.3.2 抗原包被PCR管 熒光定量PCR管用50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的戊二醛溶液37℃包被5 h，超純水振蕩洗滌 PCR 管 3 次，每次 5 min；50 μL 0.1 μg/mL的 BPA抗原包被 PCR管，37℃包被 2 h，100 μL pH 7.2 PBST（含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.05%Tween-20 PBS）緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min，再用100 μL pH 7.2封閉液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA-PBS緩沖液）37℃封閉 2 h。上述PBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min。

1.3.3 免疫傳感器的構(gòu)建 取上述包被好的PCR管，加入25 μL 10倍梯度稀釋的BPA標(biāo)準(zhǔn)品，再加入25 μL DNA-BPA抗體偶聯(lián)物，標(biāo)準(zhǔn)品中的BPA與PCR管壁上包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，37℃反應(yīng)30 min。用PBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min，最后將PCR管在吸水紙上拍打干凈。加入SYBR?Premix EX TaqTMⅡ2×Buffer 10 μL， 上游引物、下游引物各 0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足到20 μL。熒光定量PCR儀測(cè)定。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。獲得偶聯(lián)DNA的擴(kuò)增曲線(xiàn)、熔解曲線(xiàn)。

1.3.4 樣品檢測(cè) 選取PC成品型食品接觸材料作為檢測(cè)研究對(duì)象，參照GB/T 5009.156-2003《食品用包裝材料及其制品的浸泡試驗(yàn)方法通則》和SN/T 2199-2008《食品接觸材料 塑料 水狀食品模擬物總遷移量試驗(yàn)方法 填充法》，用水、體積分?jǐn)?shù)10%乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%乙酸，95℃恒溫水浴浸泡6 h，水直接進(jìn)行免疫PCR檢測(cè)，體積分?jǐn)?shù)10%乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%乙酸稀釋100倍后進(jìn)行免疫PCR檢測(cè)。雙酚A特定遷移量折合成實(shí)際接觸面積，按歐盟2002/72/EC法則規(guī)定的方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光PCR檢測(cè)

熒光定量PCR采用SYBR?GreenⅠ嵌合熒光染料，從溶解曲線(xiàn)上可見(jiàn)78℃處有單一峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)中的SYBR?Premix EX TaqTMⅡ熒光 PCR試劑采用 SYBR?GreenⅠ嵌合熒光染料，能夠在較寬的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，具有抑制非特異性反應(yīng)、再現(xiàn)性好的特性。

圖1 熒光PCR溶解曲線(xiàn)Fig.1 Dissociation curve of fluorescence PCR

2.2 包被原、DNA-抗體偶聯(lián)物濃度的優(yōu)化

包被原和DNA-抗體偶聯(lián)物的質(zhì)量濃度比例按照ELISA棋盤(pán)法進(jìn)行優(yōu)化，包被原的質(zhì)量濃度參照普通ELISA的包被質(zhì)量濃度，從1.0 μg/mL 10倍梯度稀釋至0.01 ng/mL，抗體-DNA偶聯(lián)物 （抗體38.4 ng/mL、DNA 40 nmol/L）2 倍梯度稀釋至 1.2 ng/mL（以抗體質(zhì)量濃度計(jì)），加入同樣質(zhì)量濃度的BPA進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，根據(jù)同一條件下加入目標(biāo)物和未加目標(biāo)物循環(huán)數(shù)的差值，選取最合適的質(zhì)量濃度配比。擴(kuò)增效率越高，循環(huán)數(shù)差值越大，最終確定包被原質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL，抗體質(zhì)量濃度為9.6 ng/mL，DNA 濃度為 10 nmol/L，見(jiàn)圖 2。

圖2 棋盤(pán)優(yōu)化法ΔCt值Fig.2 ΔCtvalue of checkerboard optimization method

橫坐標(biāo)為不同抗體-DNA偶聯(lián)物濃度 （以抗體質(zhì)量濃度計(jì)），縱坐標(biāo)為不同體系中加入目標(biāo)物和不加目標(biāo)物循環(huán)數(shù)（Ct值）的差值，曲線(xiàn)分別代表不同包被原質(zhì)量濃度。

2.3 線(xiàn)性范圍與檢測(cè)限

固定包被原質(zhì)量濃度0.1 μg/mL、抗體質(zhì)量濃度 9.6 ng/mL、DNA濃度 10 nmol/L， 優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)性BPAμ濃度：從1.0 μg/mL 10倍梯度稀釋至1.0 fg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Ct值隨著加入標(biāo)準(zhǔn)品BPA質(zhì)量濃度的增加而增大，見(jiàn)圖3，當(dāng)BPA質(zhì)量濃度大于0.1 ng/mL時(shí)，Ct值與空白對(duì)照 （不加BPA標(biāo)準(zhǔn)品）無(wú)明顯差異。

圖3 競(jìng)爭(zhēng)性BPA濃度條件優(yōu)化PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.3 OptimizationImmuno-PCR amplificationof competitive BPA

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在10.0 fg/mL～10.0 pg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)圖4，線(xiàn)性方程為y=0.449x+8.245，相關(guān)系數(shù)為0.994 0，檢測(cè)底限為3.0 fg/mL。

圖4 BPA免疫PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve of BPA by Immuno-PCR

2.4 回收率與精密度

以待測(cè)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度計(jì)算，選擇高（10.0 pg/mL）、中（0.5 pg/mL）、低（0.01 pg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度，分別添加在水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%乙酸、體積分?jǐn)?shù)10%乙醇浸泡樣品中，每個(gè)添加平行測(cè)定6次，取平均值計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度（見(jiàn)表1）。

2.5 樣品的遷移檢測(cè)

采用95℃高溫浸泡、選擇水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%乙酸、體積分?jǐn)?shù)10%乙醇對(duì)不同待測(cè)樣品進(jìn)行BPA遷移檢測(cè)。結(jié)果表明：不同廠(chǎng)家、不同材質(zhì)以及相同材質(zhì)不同質(zhì)地的食品接觸材料BPA的遷移量都不同，其中相同材質(zhì)、質(zhì)地更為緊密的食品接觸材料BPA遷移量更少。

表1 樣品添加回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions of samples （n=6）

3 結(jié)語(yǔ)

作者建立了食品接觸材料中BPA的免疫PCR快速檢測(cè)方法，方法快速簡(jiǎn)便。通過(guò)對(duì)免疫PCR方法條件的優(yōu)化、空白樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)，以及實(shí)際樣品的遷移檢測(cè)，證實(shí)所建立的方法適合用于食品接觸材料中BPA的痕量遷移檢測(cè)。

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