陳立立 ， 唐 雪 ，2， 徐圓媛 ， 余 靜 ， 樂(lè)國(guó)偉 ，2， 施用暉 *，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

氧化應(yīng)激是指機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。過(guò)多自由基會(huì)作用于生物大分子，破壞細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、炎癥、衰老、癌癥等的發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。有研究表明，糖尿病患者體內(nèi)自由基活性增強(qiáng)，各種抗氧化酶如SOD、CAT等活力都降低，GSH、VC、VE等具有抗氧化能力的物質(zhì)水平也會(huì)降低[2]。T3是機(jī)體內(nèi)甲狀腺激素的主要生物活性形式[3]。既往臨床工作中發(fā)現(xiàn)，許多2型糖尿病患者血清FT3水平較正常組顯著下降，且隨著病齡的延長(zhǎng)T3水平降低越顯著[4]。肝硬化患者體內(nèi)血清T3水平與血清MDA水平呈負(fù)相關(guān)，與GSH和GSHPx水平呈正相關(guān)[5]。張洪梅等[6]研究表明，隨著甲狀腺激素缺乏時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，抗氧化損傷能力不足以代償活性氧造成的損傷，最后出現(xiàn)腦損傷。另有研究表明，T3預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)肝臟缺血再灌注損傷引起的GSH、MDA改變，有效保護(hù)小鼠肝臟缺血再灌注損傷[7]。且有研究表明，T3可作為促進(jìn)胰島β細(xì)胞存活和抗其凋亡的保護(hù)因子[8]。因此，推測(cè)T3可能具有抗氧化保護(hù)功能。

核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子（Nrf2）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激等情況下與Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白質(zhì)1（Keap1）解離，進(jìn)入胞質(zhì)啟動(dòng)Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因（如NQO1、HO-1）的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激和親電子化學(xué)物質(zhì)的抗性[9]。已有研究表明，T3處理大鼠可導(dǎo)致N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理的肝臟Nrf2活性的提高[10]。PI3K是Nrf2的上游調(diào)節(jié)因子，抑制PI3K會(huì)阻斷Nrf2的核易位及誘導(dǎo)應(yīng)激蛋白質(zhì)表達(dá)，因此在維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)方面也起到重要作用[11]。

過(guò)氧化氫是一種重要的活性氧，其易于獲得，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，所以它已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具[12]。作者以人肝癌細(xì)胞（HepG2）為基礎(chǔ)，以過(guò)氧化氫為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，構(gòu)建體外氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，加入不同濃度的T3處理，從細(xì)胞自由基水平、存活率、多種抗氧化酶活及 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1等基因表達(dá)水平等多角度，全面分析T3的抗氧化作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2 試劑及儀器

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司；T3，購(gòu)自Sigma 公司；胰蛋白酶（Trypsin），購(gòu)自 Amresco 公司；新生小牛血清，購(gòu)自中國(guó)杭州四季青生物技術(shù)有限公司；活性氧檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、Trizol、RT-PCR相關(guān)試劑，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；T-AOC測(cè)試盒、SOD測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)試盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

多功能酶標(biāo)儀，Biotek公司制造；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司制造；還有日立7000型熒光分光光度計(jì)，Olympus倒置顯微鏡等。

實(shí)驗(yàn)中部分引物用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞按5×105個(gè)/mL接種在含體積分?jǐn)?shù)10%滅活新生小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中（pH 7.2），37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞為多角形貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷模型的建立

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，加入常規(guī)培養(yǎng)液；H2O2處理2 h組，加入培養(yǎng)液和 H2O2，H2O2終濃度分別為 10、50、100、200 μmol/L；H2O2處理4 h組，加入培養(yǎng)液和H2O2，H2O2終濃度分別為 10、50、100、200 μmol/L。

1.4.2 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以105個(gè)/mL密度接種于96孔板上，每組6孔，于37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，去除培養(yǎng)液，加藥物處理，每孔100 μL，處理結(jié)束后棄上清液，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基和 20 μL 5 g/L 的 MTT，溫育 4 h，去除培養(yǎng)液及MTT，每孔加入200 μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)570 nm處的吸光度。

1.4.3 ROS探針?lè)z測(cè)細(xì)胞自由基水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以105個(gè)/mL密度接種于96孔的透明底黑板，待細(xì)胞增長(zhǎng)80%左右，加探針DCFH-DA（事先用無(wú)血清的培養(yǎng)基以體積比1∶1 000 稀釋?zhuān)?00 μL，30 min 后棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗兩遍，加H2O2，處理完后用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.5 檢測(cè)T3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞ROS及存活率的影響

實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組；高中低濃度H2O2處理組；H2O2+T3 組 （T3 濃度為 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，用無(wú)血清培養(yǎng)基配制）；陽(yáng)性對(duì)照H2O2+硫辛酸LA組（LA濃度為100 μmol/L）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以104個(gè)/mL密度接種于96孔板，24 h后加T3孵育，24 h后棄上清液，加H2O2處理，檢測(cè)細(xì)胞存活率及ROS水平。

1.6 檢測(cè)T3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞抗氧化物/酶的影響

實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，100 μmol/L H2O2處理組，H2O2+高中低T3組，H2O2+LA組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以 3×105個(gè)/mL密度接種于 6孔板，24 h后加T3孵育，48 h后棄上清液，加H2O2處理。處理完后每孔加入300 μL細(xì)胞裂解液收集。3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)測(cè)定，然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行T-AOC、GSHPx、SOD、MDA 的測(cè)定。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)目的基因的表達(dá)

以1.6方法處理細(xì)胞，處理完后每孔加入1 mL Trizol，用氯仿/異丙醇/乙醇法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，并用微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定所提取RNA的濃度及純度。RT-PCR擴(kuò)增目的片段，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列為：內(nèi)參β-actin上游引物 5'-TCCCTCAAGATTCTCAGCA-3'，下游引物 5'-ACATCCACAACGCATACA-3'；Nrf2 上游引物 5'-GATGGGTTGGACTGGTGGTGGTT-3'，下游引物 5'-CTCTCGGAGCGGGCGTAGTTTCT-3'；PI3K 上 游 引物5'-TGTACTGGGCCTCATGCACCT-3'，下游引物5'-GGCAAAGCGGCAGTAGTAGAGTAG-3'；NQO1上游引物 5'-GTGGTGGAGTCGGACCTCTATG-3'，下游引物 5'-AAGCCAGAACAGACTCGGCAG-3'；HO-1上游引物5'-ATGACACCAAGGACCAGAG-3'，下游引物 5'-TAAGGACCCATCGGAGAAG-3'。按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：95℃作用5 min；95℃反應(yīng)20 s，62℃反應(yīng) 30 s，72℃反應(yīng) 20 s；72℃作用2 min。其中第2步到第4步（變性、退火、延伸）設(shè)置40個(gè)循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析和鄧肯氏多重比較，分析各組間的差異顯著性。顯著水平為p＜0.05，極顯著水平為p＜0.01。數(shù)據(jù)用垂直條形圖和mean±S.D.形式表示。

2 結(jié)果分析

2.1 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞ROS及存活率的影響

10、50、100、200 μmol/L 的 H2O2處理 HepG2 細(xì)胞2、4 h后檢測(cè)細(xì)胞存活率及ROS（圖1）。

圖1 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞ROS及存活率的影響Fig.1 Effects of H2O2on ROS and cell viability in HepG2

由圖1可以觀察到，隨著H2O2濃度的提高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，ROS水平逐漸提高。100μmol/L的H2O2處理HepG2細(xì)胞4 h后，細(xì)胞存活率為80%左右，ROS提高至300%左右，與正常細(xì)胞差異顯著 （P＜0.05），提示此濃度可建立HepG2細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型。這與韓飛、Farombi等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[12-13]。

2.2 T3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞ROS及存活率的影響

HepG2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，加入不同濃度的T3繼續(xù)培養(yǎng)48 h后再用H2O2處理，測(cè)定細(xì)胞存活率及ROS。如圖2所示，不同濃度的T3對(duì)細(xì)胞存活率及 ROS 產(chǎn)生了不同影響。10-9、10-7、10-5mol/L 的T3 可分別顯著提高 50、100、200 μmol/L H2O2氧化損傷的細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞 ROS（P＜0.05），但10-5mol/L的T3反而降低50 μmol/L H2O2氧化損傷的細(xì)胞的存活率，增加細(xì)胞ROS。最佳作用劑量的T3效果與100 μmol/L LA效果相當(dāng)。

圖2 T3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞ROS及存活率的影響Fig.2 Effects of T3 on ROS and cell viability of H2O2 reduced HepG2 cells

2.3 T3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞抗氧化酶的影響

見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，100 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)T-AOC、SOD及GSH-Px活性均顯著降低，MDA 含量顯著提高 （P＜0.05）。 加入 10-5、10-7、10-9mol/L的T3可不同程度地提高細(xì)胞T-AOC、SOD及GSH-Px活性，降低MDA含量。其中10-7mol/L T3處理組與H2O2組細(xì)胞差異最顯著（P＜0.01）。 結(jié)果表明，T3對(duì)氧化損傷的HepG2細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)起到了明顯的改善作用，且T3作用效果與使用劑量相關(guān)。

2.4 T3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因的影響

見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，100 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi) PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1 表達(dá)均顯著降低，加入T3可不同程度地提高細(xì)胞這些基因的表達(dá)。其中10-7mol/L T3對(duì)PI3K、Nrf2、NQO1的表達(dá)提高作用最顯著 （P＜0.01），10-9mol/L T3 對(duì) HO-1 的表達(dá)提高作用最顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，T3對(duì)氧化損傷的HepG2細(xì)胞的抗氧化關(guān)鍵基因的表達(dá)有影響，且與劑量有關(guān)。

表1 T3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞 T-AOC、SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響（x±s，n=3）Table 1 Effect of T3 on T-AOC，SOD，GSH-Px activities and MDA content in H2O2reduced HepG2 cell（x±s，n=3）

表2 T3 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1 表達(dá)的影響（x±s，n=3）Table 2 Effect of T3 on the expression of PI3K，Nrf2，NQO1 and HO-1 in H2O2reduced HepG2 cell（x±s，n=3）

3 討論

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化和抗氧化水平失去平衡的后果，過(guò)量的活性氧會(huì)引起分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷[14]。大量研究表明[15]，氧化應(yīng)激是代謝綜合征發(fā)生和發(fā)展的重要病因之一。甲狀腺激素參與機(jī)體的正常代謝，與組織器官的氧化和抗氧化狀態(tài)有著重要關(guān)系。

通過(guò)體外建立HepG2細(xì)胞H2O2氧化損傷模型，初步研究了T3對(duì)氧化損傷細(xì)胞存活率、ROS水平、抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，10、50、100、200 μmol/L H2O2可顯著提高胞內(nèi)ROS水平，降低細(xì)胞存活率，表明HepG2細(xì)胞的ROS水平和存活率與H2O2作用濃度存在劑量效應(yīng)。為了更好地探究T3作用劑量與細(xì)胞損傷程度之間的關(guān)系，選擇低中高3個(gè)H2O2濃度。比較發(fā)現(xiàn)，對(duì) 50、100、200 μmol/L H2O2處理的 HepG2 細(xì)胞，T3抗氧化保護(hù)作用存在差異。 10-9、10-7、10-5mol/L T3可分別顯著降低 50、100、200 μmol/L H2O2處理的細(xì)胞的 ROS水平，增加細(xì)胞存活率（p＜0.05），表明T3最佳作用劑量與細(xì)胞氧化損傷程度有關(guān)。有研究表明，補(bǔ)充外源性甲狀腺激素對(duì)外科重癥時(shí)的器官有保護(hù)作用，這已在心、肺、器官移植中得到初步證實(shí)[16]。雖然甲狀腺激素的器官保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚，但已有研究顯示可能與甲狀腺激素可以抑制細(xì)胞凋亡等有關(guān)[17]。因此，T3對(duì)H2O2氧化損傷的HepG2細(xì)胞有保護(hù)作用可能與T3能抑制HepG2細(xì)胞凋亡和清除ROS有關(guān)。近年來(lái)越來(lái)越多證據(jù)表明，VA、VC、VE、異黃酮、硫辛酸等被用作抗氧化的物質(zhì)，在低劑量使用條件下表現(xiàn)抗氧化作用，而在高劑量作用下卻表現(xiàn)促氧化作用[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，10-5mol/L T3反而增加 50 μmol/L H2O2處理的細(xì)胞的ROS水平，降低細(xì)胞存活率，說(shuō)明在低程度損傷時(shí)，細(xì)胞有自行調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的能力，而高濃度T3會(huì)通過(guò)增加細(xì)胞代謝而產(chǎn)生更多自由基，從而損害細(xì)胞；而隨著損傷加重，T3逐漸顯現(xiàn)抗氧化作用，且損傷程度越嚴(yán)重，T3所需濃度越大。

為了進(jìn)一步探究T3抗氧化保護(hù)作用的可能機(jī)制，作者檢測(cè)了胞內(nèi)T-AOC、GSH-Px及SOD活性和MDA含量及一些抗氧化相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，100 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)TAOC、GSH-Px及SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（p＜0.05），說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡被打破，造成細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。加入T3可顯著降低細(xì)胞MDA含量，提高T-AOC、GSH-Px及SOD活性，其中10-7mol/L T3作用效果最顯著，這與自由基及存活率結(jié)果一致。核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子（Nrf2）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激時(shí)被激活，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)啟動(dòng)Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性[19]。研究發(fā)現(xiàn)，T3添加1 h和2 h后，細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Nrf2水平顯著提高，胞質(zhì)內(nèi)Nrf2水平減少，即T3處理會(huì)誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞Nrf2活化。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究結(jié)果顯示，加入T3可顯著提高細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，同時(shí)，Nrf2的上游調(diào)控因子PI3K及下游Ⅱ相酶基因NQO1及HO-1的表達(dá)均顯著提高。但是本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的是細(xì)胞總的Nrf2的表達(dá)，下一步可以將T3處理的細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離，分別測(cè)定Nrf2水平的變化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T3可通過(guò)提高PI3K的表達(dá)從而提高Nrf2的表達(dá)，繼而提高下游Ⅱ相酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性，降低MDA生成，從而降低細(xì)胞自由基水平，提高細(xì)胞存活率，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用。但過(guò)高濃度T3反而可能因刺激細(xì)胞代謝增強(qiáng)，產(chǎn)生過(guò)多自由基而起促進(jìn)氧化的作用。

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