蘇樂 陳小彬 蘭志嶺 牛志彬

(1.北京天壇生物制品股份有限公司質(zhì)量保證部驗證室 北京 100024;2.北京天壇生物制品股份有限公司質(zhì)量保證部 北京 100024)

我們已經(jīng)實施了SHINVA脈動真空滅菌柜(XG1.GMF-1.5B型號)的確認-驗證工作。以下的實驗為飽和蒸汽脈動真空周期的裝載包含50個250ml瓶子內(nèi)裝200ml葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的驗證程序。

葡萄糖肉湯培養(yǎng)基是熱敏感培養(yǎng)基,在高壓滅菌工藝中容易發(fā)生理化性質(zhì)改變。所以,滅菌參數(shù)必須仔細選擇。

本文中所指的微生物實驗室使用滅菌培養(yǎng)基進行非無菌產(chǎn)品微生物檢驗和培養(yǎng)。

1 材料和方法

根據(jù)藥典推薦[1],液體培養(yǎng)基的參考滅菌條件(121℃暴露15分鐘)。初步試驗確定裝載的滯后時間特性。首先用50個瓶裝有200ml自來水來模擬裝載。

為了監(jiān)測裝載條件下腔室獲得的溫度,16個探頭放置在腔室的多個位點,另外12個放置在瓶子所含液體的中部。 腔室溫度探頭的放置和裝載圖見圖1熱分布。

當放置在排水口的溫度探頭達到滅菌溫度時開始計算延遲時間。當放置于裝載中的最后一個探頭溫度達到滅菌溫度時計時結(jié)束[2]。

熱穿透試驗與生物指示劑試驗同時實施。含有5*106數(shù)量的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子安瓿放置在每一個裝載中溫度探頭旁。對于安瓿瓶,按12個熱穿透瓶子的編號分配。在插入熱溫度探頭后,滅菌的安瓿在55-60℃培養(yǎng)7天,以滅菌的安瓿做陽性對照,并每天檢測細菌生長情況。作為一種確認滅菌效率的方法,滅菌后50瓶葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中的5瓶在32℃培養(yǎng)5天。培養(yǎng)基每天檢測其細菌生長性[3]。

圖1 熱分布放置示意圖

檢測滅菌后培養(yǎng)基效度,葡萄糖肉湯培養(yǎng)基依據(jù)生長促進試驗。在枯草桿菌芽孢存在的條件下在37℃培養(yǎng)48小時檢測培養(yǎng)基的生長促進試驗。

另一種確認培養(yǎng)基和緩沖液物理性質(zhì)完整性的方法是在滅菌前后檢測其PH值。對于葡萄糖肉湯培養(yǎng)基pH應在7.3±0.2。

2 結(jié)果

對于同樣的裝載,測量到延遲50分鐘。培養(yǎng)基粘性略高于自來水。除了所需暴露時間15分鐘外,平衡50分鐘可認為足夠。

應用裝載內(nèi)的溫度探頭所記錄的溫度分布表明在暴露期裝載的溫度略低于設(shè)定溫度121℃。驗證試驗應用的設(shè)定溫度121℃30分鐘。圖1是熱分布示意圖,排水口的探頭為15號,3次運行的熱分布溫度探頭獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)見表3。培養(yǎng)基瓶熱穿透的數(shù)據(jù)總結(jié)見表4。

當觀察到熱分布每次運行計算出平均溫度時,要清楚5位置是腔室熱點。導軌下的15和16位置作為腔室冷點考慮。分析排水管位置和腔室其它幾何位置的平均溫度數(shù)據(jù)進行t檢驗并無統(tǒng)計學顯著差異95%的可信度。(除了3號,位于腔室上角遠離蒸汽進氣口,這個非關(guān)鍵因素,因為沒有裝載會達到這個位置)。

熱穿透溫度數(shù)據(jù)表明23和26位是溫度高點17和28位是冷點,多點記錄數(shù)據(jù)證明在95%可信限無統(tǒng)計學差異(圖4)。

每30秒溫度讀取計算F0值,計算如下:

該循環(huán)的總時間溫度大于100℃獲得的殺菌效果 ,計算包括加熱的整個暴露階段和部分升溫及冷卻階段。滅菌器溫度探頭達到滅菌溫度的時間作為t0,而后循環(huán)開始。分析致死率確定各次運行間F0均值95%置信區(qū)間(表5)。

圖2 熱分布于熱穿透時間曲線

表3 暴露期熱分布溫度數(shù)值

表4 暴露期熱穿透溫度值

表5 熱穿透累積F0值

表6 每次運行所獲得的無菌保障水平

每次運行確定所達到的無菌保證水平,計算低限95%置信區(qū)間帶入用于計算F0等式,重新排列等式,即可確定概率P作為絕對值Nt。

正如制造商所提供的合格證書中顯示,D121被確定為1.5分鐘,N0為106.計算所得的95%置信區(qū)間的Nt下限顯示在表6中?？梢缘贸鼋Y(jié)論,如果按照本研究所采用的裝載,95%置信區(qū)間一個生物體存在的概率是10-10或更低。

3 討論

前述方法基于最壞情況的假設(shè)即每件物品上存在106孢子必須被滅菌,生物負荷的微生物與噬熱脂肪肝菌芽孢同樣的熱抗性。然而達到無菌保證水平10-12就沒有必要,因為用于準備培養(yǎng)基的原材料為純化品及低的生物負荷。

實驗中所使用的生物指示劑同樣表明有足夠的無菌保證水平。滅菌后,安瓿瓶中所有芽孢被殺滅,而后進行7天50-60℃的培養(yǎng)。培養(yǎng)期后陽性對照顯示有細菌生長。

培養(yǎng)后5天目視檢查顯示無細菌生長。一瓶未滅菌的培養(yǎng)基作為陽性對照進行培養(yǎng),在培養(yǎng)基變渾濁。這將確定滅菌工藝有效性的結(jié)論。

培養(yǎng)基在滅菌后的活度同樣經(jīng)過促生長試驗確認。滅菌后,培養(yǎng)基接種谷草芽孢桿菌37℃培養(yǎng)48小時,顯示陽性芽孢生長。培養(yǎng)基變渾濁的事實確認其穩(wěn)定性及在滅菌過程中化學成分沒有發(fā)生變化,接種合適的微生物仍能支持生長。

滅菌后進行三次pH檢測。所有pH值在7.15-1.17范圍內(nèi),確認了滅菌后保留了培養(yǎng)基的理化性質(zhì)。當然,滅菌后三人獨立的目視檢測確認無顏色變化或沉淀現(xiàn)象。

可以斷定的是,對于所研究的生物負荷,已經(jīng)達成PQ階段研究的目標。在滅菌階段獲得的監(jiān)測物理參數(shù)揭示運行中腔室內(nèi)溫度的均勻分布,即裝載中所有的熱穿透,亦能通過三次重復。所有運行均能達到藥典SAL為10-6或更高的要求。

用于負載滅菌的條件是介于過殺和生物負載法之間。這種方法提供在滅菌程度和培養(yǎng)基穩(wěn)定性間可接受的理想的平衡。我們的結(jié)論是高壓滅菌柜連續(xù)三次在功能參數(shù)范圍內(nèi)良好的工作并提供SAL 10-10或更高。

4 結(jié)語

盡管驗證方法遵循諸多標準步驟,但并不能提供準確的方法,因為存在著許多高壓滅菌柜類型和每個單元有特異的操作參數(shù)。對于熱不穩(wěn)定物品,既節(jié)約能源的角度,我們每一次都需在物理參數(shù)與生物負載之間找到平衡。

[1]《中華人民共和國藥典》2010年版.微生物檢測滅菌法.

[2]Technical Report No.1 Validation of Moist Heat Sterilization Processes:Cycle Design, Development, Qualification and Onging Control,Vol. supplement. (2007).

[3]《中華人民共和國藥典》2010年版,附錄XI J微生物限度檢查.