唐鼎

(中山大學(xué)工學(xué)院 廣東廣州 510006)

核酸適體是化學(xué)抗體的別稱,其功能與抗體相似,具有一定的識(shí)別功能,屬單鏈短核糖核酸。本研究中通過(guò)將乳腺癌細(xì)胞MCF1OAT1作為靶向細(xì)胞,篩選化學(xué)抗體KMF2-1a,后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該核算具有良好的識(shí)別靶細(xì)胞能力[1]。本研究以探討化學(xué)抗體KMF2-1a能否被靶細(xì)胞特異性內(nèi)吞為最終目標(biāo),分析總結(jié)其藥物開(kāi)發(fā)潛力。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞核系

選取人乳腺癌細(xì)胞系MCF-1OAT1和正常上皮細(xì)胞MCF1OA1,培養(yǎng)基含有20μg/ml的胰島素、20ng/ml表皮細(xì)胞因子、5%的馬血清,癌細(xì)胞在37℃下5%的二氧化碳濃度下無(wú)菌培養(yǎng)。

1.2 試劑及裝置

洗滌緩沖液:用于清洗細(xì)胞,以便去除細(xì)胞雜質(zhì)以及熒光基團(tuán)。其調(diào)配方法為:以杜氏磷酸鹽緩沖液為基液,在其中加入4.5g/L的葡萄糖以及5mmol/L的氯化鎂,搖勻后于4℃無(wú)菌保存。

結(jié)合緩沖液:用于細(xì)胞與核酸適體結(jié)合以及熒光基團(tuán)與核酸適體結(jié)合。其調(diào)配方法為:以杜氏磷酸鹽緩沖液為基液,在其中加入4.5g/L的葡萄糖以及5mmol/L的氯化鎂,血清蛋白1mg/ml,搖勻后于4℃無(wú)菌保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用DNA合成儀將核酸適體合成,同時(shí)采用Biotin進(jìn)行修飾,同時(shí)藥物基團(tuán)不經(jīng)熒光基團(tuán)修飾。靶向細(xì)胞MCF-1OAT1通過(guò)胰蛋白酶進(jìn)行消化,之后繼續(xù)培養(yǎng),其培養(yǎng)密度為培養(yǎng)皿的70%。經(jīng)過(guò)24小時(shí)后使用。使用前以洗滌緩沖液沖洗,以去除多余培養(yǎng)基,另加入核酸適體KMF2-1a,在4℃下培養(yǎng)30分鐘。以分光光度計(jì)檢測(cè),將阿霉素溶于杜氏磷酸鹽溶液,其阿霉素溶液濃度為2μmol/L,同時(shí)加入不同濃度的GC混勻。

2 結(jié)果

2.1 特異內(nèi)吞

在經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理之后,能夠去除靶向細(xì)胞膜上的相關(guān)信號(hào),后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)4℃下熒光信號(hào)來(lái)自細(xì)胞內(nèi)不,證明核酸適體能夠被內(nèi)吞,而對(duì)照組并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部存在熒光信號(hào),不能夠被內(nèi)吞。

2.2 藥物載體競(jìng)爭(zhēng)

過(guò)量的藥物載體在與靶細(xì)胞充分培養(yǎng)之后導(dǎo)致信號(hào)減弱,故核算適體的結(jié)合位減少,能夠保證核算適體的識(shí)別能力未發(fā)生降低。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

3 討論

由于核酸適體的理化性質(zhì)具有極高的優(yōu)良性,同時(shí)其極易被修飾,這就保證了其具有被進(jìn)一步應(yīng)用的可能性[2]。雖然大部分核酸適體在不借助外力的情況下并不能同小分子一樣被細(xì)胞內(nèi)吞,制約了其適用性,但由于其極高的易修飾性能夠使其很容易借助外力的作用,在本研究中,正是通過(guò)這樣的外力修飾而使得核酸適體更加容易被細(xì)胞內(nèi)吞。在本研究的實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞處于4℃的環(huán)境中會(huì)使得細(xì)胞及細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài),此種情況下核酸適體與小分子具有明顯的差異,小分子可以自由通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)出細(xì)胞,而核酸適體則很難通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)出細(xì)胞,此時(shí)培養(yǎng)出的核酸適體均處于細(xì)胞外部。在培養(yǎng)結(jié)束后,以洗滌劑將未發(fā)生結(jié)合的核酸適體沖洗掉,將細(xì)胞放于常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境則會(huì)使細(xì)胞恢復(fù)活性,這種情況下核酸適體被靶細(xì)胞內(nèi)吞。另通過(guò)胰蛋白酶將細(xì)胞膜消化掉,之后觀察到的熒光則發(fā)自于細(xì)胞內(nèi)部,此證實(shí)核酸適體被細(xì)胞正常內(nèi)吞。

表1 靶細(xì)胞內(nèi)吞核酸適體數(shù)據(jù)比較

在現(xiàn)階段的研究中,證實(shí)核酸適體能夠被前列腺癌細(xì)胞內(nèi)吞,通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)將納米材料與核酸適體聚合,此證明該納米材料能夠?qū)⒑怂徇m體通過(guò)特殊途徑運(yùn)送至靶細(xì)胞內(nèi)部。藥物載體在本研究中采用KMF2-1a生成,故其能夠保證核酸適體的序列并不發(fā)生變化,這樣能夠使其空間形成折疊,在此之后首先測(cè)定其是否能夠與靶細(xì)胞結(jié)合,若不能結(jié)合則將細(xì)胞與藥物載體進(jìn)行共同培養(yǎng),之后再以定量核算適體進(jìn)行培養(yǎng)。藥物載體在其競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)識(shí)別靶細(xì)胞并結(jié)合證明在內(nèi)吞研究中靶細(xì)胞能夠攜帶熒光基團(tuán),在試驗(yàn)中通過(guò)延長(zhǎng)核酸適體的堿基并嵌入阿霉素證明此種情況并不影響靶細(xì)胞的內(nèi)吞。以這些研究為基礎(chǔ),利用抗PSMA核酸適體為載體,將siRNA、毒素、抗腫瘤藥物靶向運(yùn)輸?shù)角傲邢侔┘?xì)胞的研究成為該癌癥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

蒽環(huán)類藥物的激發(fā)光譜約為600nm,其中存在2個(gè)吸收峰值,當(dāng)小分子藥物與堿基對(duì)進(jìn)行配對(duì)時(shí)則會(huì)導(dǎo)致吸收峰值的消失,在學(xué)術(shù)界將阿霉素?zé)晒庑盘?hào)消失的現(xiàn)象稱之為淬滅,通過(guò)該淬滅現(xiàn)象能夠檢測(cè)到阿霉素是否能夠成功進(jìn)入藥物載體,另外隨著藥物載體濃度的增加會(huì)導(dǎo)致阿霉素信號(hào)的峰值有節(jié)奏的消失,這就證明阿霉素與堿基配對(duì)成功。

綜上所述,本研究中采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)能夠證實(shí)靶細(xì)胞MCF-1OAT1具有特異內(nèi)吞核酸適體KMF2-1a,在隨后的核酸適體加入堿基作為藥物載體的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)采用阿霉素能夠嵌入堿基,并對(duì)互補(bǔ)空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響,在此基礎(chǔ)之上成功制成的藥物載體與阿霉素能夠形成物理共聚,這就能夠?yàn)槠溥M(jìn)一步研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]牛瑞芳.腫瘤特異性標(biāo)志及生物靶向納米制劑的研究[D].天津:天津大學(xué),2012.

[2]陳帥君.葉酸受體介導(dǎo)的載順鉑磁性納米pH敏感靶向給藥系統(tǒng)研究[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2013.

[3]楊傳旭,葛志強(qiáng).以適體作為藥物“靶向載體”的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù),2010,04(05):1297-1299.