余宏偉+廖志偉+莊雅靖+喻芳+周同沖

[摘要] 目的 構(gòu)建并鑒定USP22基因ShRNA慢病毒載體，為進(jìn)一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法 針對(duì)USP22基因的編碼序列設(shè)計(jì)并合成2條特異性干擾序列，序列兩端含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HpaⅠ和XhoⅠ。寡核苷酸鏈退火生成寡核苷酸雙鏈，5′端磷酸化后將含有酶切位點(diǎn)的寡核苷酸雙鏈克隆到pLL3.7慢病毒表達(dá)載體。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒，提取出來(lái)的質(zhì)粒經(jīng)HpaⅠ和XhoⅠ酶切電泳鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體pLL-USP22-shRNA與包裝載體質(zhì)?；靹蚬厕D(zhuǎn)染于293T細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）情況，對(duì)病毒滴度和感染效率進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLL-USP22-shRNA。與包裝載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后測(cè)定慢病毒滴度為4×107 TU/ml。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用相關(guān)技術(shù)成功構(gòu)建USP22 ShRNA慢病毒載體，為進(jìn)一步研究USP22基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] USP22；慢病毒載體；構(gòu)建；鑒定

[中圖分類號(hào)] R34 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）11（b）-0009-05

腫瘤細(xì)胞中基因表達(dá)具有組織特異性，USP22泛素水解酶屬去泛素化酶DUB基因家族成員，其普遍表達(dá)表明其功能的保守性，因此，USP22被歸類為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記基因而引起高度關(guān)注[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，USP22基因過(guò)表達(dá)與結(jié)直腸癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后差高度相關(guān)。沉默USP22基因表達(dá)，能顯著抑制膀胱癌[7]、結(jié)直腸癌[8]細(xì)胞增殖，由此推測(cè)USP22基因可能成為腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。本研究通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建USP22 ShRNA慢病毒載體，為進(jìn)一步研究USP22基因在人鼻咽癌細(xì)胞中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

pLL3.7慢病毒表達(dá)載體及包裝載體質(zhì)粒購(gòu)自廣州永諾生物科技有限公司。T4磷酸化酶、T4連接酶、HpaⅠ酶及XhoⅠ酶均購(gòu)自NEB（New England BioLabs）公司。瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司。高純質(zhì)粒小量提取試劑盒和Tran5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物公司。質(zhì)粒大提試劑盒（QIAGEN試劑盒）購(gòu)自QIAGEN公司。溴化乙錠（EB）及LB培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Lipofectamine（脂質(zhì)體）2000購(gòu)自Life Technologies公司。主要儀器包括水浴箱、恒溫振蕩器、臺(tái)式離心機(jī)、Eppendorf加樣槍和臺(tái)式冷凍離心機(jī)、恒溫?fù)u床、電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱、Millipore超純水系統(tǒng)、Bio-Rad瓊脂糖凝膠電泳儀、SynGene凝膠成像系統(tǒng)、Olympus倒置熒光顯微鏡、-4℃冰箱、-20℃冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 SiRNA的設(shè)計(jì)與合成

運(yùn)用Promega、Invitrogen和Dharmaco公司提供的RNA干擾設(shè)計(jì)工具，并結(jié)合RNA干擾設(shè)計(jì)的原則，尋找19個(gè)堿基的靶序列。將編碼SiRNA的DNA片段設(shè)計(jì)成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩端含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HpaⅠ及XhoⅠ。SiUSP22-1：CACGGACAGTCTCAACAAT，5′-AACTCACGGACAGTCTCAACAATTT-CAAGAGAATTGTTGAGACTGTCCGTGTTTTTTC-3′，3′-TTGAGTGCCTGTCAGAGTTGTTAAAGTTCTCTTA-ACAACTCTGACAGGCACAAAAAAGAGCT-5′；SiUS-P22-2：GAAGCATATTCACGAGCAT，5′-AACTGAAGCATATTCACGAGCATTTCAAGAGAATGCTCGTGAA-TATGCTTCTTTTTTC-3′，3′-TTGACTTCGTATAAGTG-CTCGTAAAGTTCTCTTACGAGCACTTATACGAAGA-AAAAAGAGCT-5′。

1.2.2 慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.2.1 寡核苷酸鏈的退火 反應(yīng)體系：1 μg/μl正義寡核苷酸鏈，1 μg/μl反義寡核苷酸，1 μl 20×SSC Buffer，加ddH2O至20 μl。反應(yīng)條件：95℃，10 min后自然冷卻至室溫。

1.2.2.2 寡核苷酸雙鏈5′端的磷酸化 因合成的寡核苷酸鏈的5′端沒(méi)有被磷酸化，不利于載體的連接，故需要磷酸化。反應(yīng)體系：7 μl寡核苷酸雙鏈，2.5 μl 10×T4 PNK Buffer，2.5 μl ATP，0.5 μl T4磷酸化酶，加ddH2O至25 μl。反應(yīng)條件：37℃，30 min。

1.2.2.3 將含有酶切位點(diǎn)的寡核苷酸雙鏈克隆到pLL3.7載體 連接體系：1 μl pLL3.7載體，1 μl寡核苷酸雙鏈，1 μl 10×連接Buffer，1 μl T4連接酶，加ddH2O至10 μl。反應(yīng)條件：室溫，30 min。

1.2.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 ①冰浴中將50～100 ng連接產(chǎn)物分別加入至50 μl Tran5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后輕輕地旋轉(zhuǎn)使其混合均勻，冰浴時(shí)間30 min；②放置42℃的水浴箱中熱休克90 s；③快速地將管轉(zhuǎn)移至冰浴中，冰浴時(shí)間2 min；④分別加入500 μl LB培養(yǎng)基，混勻，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)40 min；⑤將150 μl菌液涂布于含氨芐青霉素（Amp）（100 μg/ml）的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉(zhuǎn)移入37℃生化培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.2.5 質(zhì)粒提取及鑒定 從平板上面各接挑取6個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，加入含有相應(yīng)抗生素的3 ml LB培養(yǎng)液中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒（高純質(zhì)粒小量提取試劑盒）。提取出來(lái)的質(zhì)粒經(jīng)HpaⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送中美泰和公司測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)大提（QIAGEN試劑盒）后保存于-20℃冰箱。

1.2.3 慢病毒載體的包裝、濃縮及滴度測(cè)定

1.2.3.1 慢病毒的包裝 ①轉(zhuǎn)染前24 h，用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，傳代到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。細(xì)胞狀態(tài)對(duì)于病毒包裝很重要，需保證良好的細(xì)胞狀態(tài)及較少的傳代次數(shù)。②轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基更換成無(wú)血清培養(yǎng)基，再將稀釋后的DNA（pLV-gene載體10 μg，pGag/Pol載體5 μg、pRev載體5 μg、pVSV-G載體5 μg）與稀釋后的Lipofectamine 2000混合，慢慢地顛倒以使相互混勻，但不要震蕩，然后在室溫下培育20 min，以形成DNA和Lipofectamine 2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。③將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，充分混勻，放置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后吸去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，在每瓶細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含10%血清的培養(yǎng)基10 ml，再放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3.2 病毒的收獲和濃縮 ①收集轉(zhuǎn)染后48 h以及72 h的293T細(xì)胞上清液。在4℃，4000×g下離心10 min，以除去細(xì)胞碎片。在0.45 μm過(guò)濾器上過(guò)濾上清液于50 ml的離心管中。②將病毒粗提液樣品加入過(guò)濾杯中（最多19 ml），蓋上蓋子，在5000×g離心，達(dá)到需要的病毒濃縮體積（通常需要10～15 min）。離心結(jié)束后過(guò)濾杯中即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，可在4℃下保存1周，或在-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存。

1.2.3.3 慢病毒滴度測(cè)定 ①在測(cè)定滴度的前一天，將293T細(xì)胞鋪于96孔板中，每個(gè)孔加入約4×104個(gè)細(xì)胞，體積為100 μl。然后根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備6～10個(gè)無(wú)菌的Ep管，在每個(gè)Ep管中加入90 μl的無(wú)血清培養(yǎng)基。②吸取待測(cè)定的病毒原液10 μl加入第一個(gè)管中，記為1E+1 μl；充分混勻后，取10 μl加入第二個(gè)管中，記為1E+0 μl。以此類推，重復(fù)相同的操作直至最后一個(gè)管。③選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 μl的培養(yǎng)基，丟棄，加入90 μl稀釋好的病毒溶液，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④培養(yǎng)24 h后，加入完全培養(yǎng)基100 μl，4 d后，通過(guò)熒光顯微鏡拍照觀察其熒光表達(dá)情況。⑤根據(jù)熒光圖片中GFP表達(dá)情況，如在觀察到熒光表達(dá)的最后一個(gè)濃度1E-4 μl組中看到有5個(gè)帶熒光的細(xì)胞，則說(shuō)明該孔中至少有5個(gè)病毒顆粒感染了細(xì)胞，則該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，就是5/（1E-4）=5×104，單位為TU/μl，也就等于5×107 TU/ml。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序

提取出來(lái)的質(zhì)粒經(jīng)HpaⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，進(jìn)行凝膠電泳形成一條約7.6 kb的DNA條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。鑒定正確的質(zhì)粒被送至北京中美泰和公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示含有與先前設(shè)計(jì)相同的干擾序列，表明USP22慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果如下。

2.2 慢病毒載體的包裝以及滴度的測(cè)定

慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，通過(guò)孔稀釋法來(lái)測(cè)定其滴度。在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，觀察到的熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少（圖2）。

通過(guò)圖2中GFP的表達(dá)情況，可以觀察到最后一個(gè)濃度為1E-4 μl組的孔中有4個(gè)帶有熒光的細(xì)胞，說(shuō)明該孔中至少有4個(gè)病毒顆粒感染了細(xì)胞，那么該病毒的滴度就觀察到的熒光細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，測(cè)定滴度為4×104 TU/μl（4×107 TU/ml），適合感染目的細(xì)胞。

3 討論

RNAi作為一種簡(jiǎn)單有效的替代基因敲除的方法，其特異性及很好的表達(dá)抑制效果成為基因功能研究的有力手段[9-10]。慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效將目的基因（或RNAi）導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系[11]。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞質(zhì)中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生RNAi干擾。慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂[12]。

USP22屬于泛素水解酶家族定位于人17號(hào)染色體，由14個(gè)外顯子組成，編碼525個(gè)氨基酸，USP22在腫瘤組織如肝癌和宮頸癌中異常地高表達(dá)，而在正常組織中呈現(xiàn)弱表達(dá)[13]。Zhang等[14-15]的研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾技術(shù)特異性沉默USP22基因可阻止Myc及其下游基因的表達(dá)及作用抑制癌細(xì)胞的異常增殖。有研究發(fā)現(xiàn)USP22在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，且表達(dá)水平與患者預(yù)后、化療耐藥等密切相關(guān)。因此USP22也被認(rèn)為可能是腫瘤早期診斷及基因治療的新靶點(diǎn)，是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志基因之一[16]。但至目前，仍未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道USP22基因在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中是否起著關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)成功設(shè)計(jì)了USP22基因的SiRNA，并成功構(gòu)建了USP22 ShRNA慢病毒載體。通過(guò)熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況測(cè)定慢病毒滴度為4×107 TU/ml，表明慢病毒載體質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，適合感染目的細(xì)胞。本研究利用相關(guān)技術(shù)成功構(gòu)建了USP22 ShRNA慢病毒載體，為進(jìn)一步研究USP22基因在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-07-09 本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2014-07-09 本文編輯：郭靜娟）