郭 芳，黃 碩

(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安 710021;*通訊作者，E-mail:guofang198419@163.com)

miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20－25個核苷酸。其不但可以直接發(fā)揮原癌基因或者抑癌基因的作用，而且可以通過降解靶mRNA或者抑制靶信使RNA(mRNA)的翻譯調(diào)節(jié)其他癌基因或者抑癌基因的表達(dá)［1，2］。據(jù)報道，miRNA 在人類的各種生物過程均發(fā)揮重要作用，如新陳代謝、分化、細(xì)胞增殖和凋亡［3］。microRNA已被證實與癌癥的發(fā)生和發(fā)展是密切相關(guān)的，其可能成為癌癥診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記物［4］。

研究表明，miR-145 在調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化［5，6］、多種惡性腫瘤(如結(jié)腸癌［7］、前列腺癌［8］、乳腺癌［9］、宮頸癌［10］等)的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)miR-145在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的研究報道尚少。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-145的靶基因，構(gòu)建pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145重組表達(dá)質(zhì)粒，通過雙熒光素酶報告基因預(yù)測miR-145對下游靶基因CDK6表達(dá)的影響，以及對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW、pmirGLO真核載體、口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞株、E.coli DH5α均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗中心提供。

T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(Hin dⅢ、Eco RⅠ、SacⅠ和 XhoⅠ)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript3?RT)均購自Takara公司(大連)，質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司，RNA抽提試劑Trizol轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國vitrogen公司，RIPA、SDSPAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，PVDF膜、蛋白發(fā)光液購自Millipore公司，鼠抗人βactin購自Santa Cruz公司，兔抗人CDK6購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 miR-145表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 從miRBase網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中檢索has-miR-145的pre-miR-145頸環(huán)序列，設(shè)計合成兩端帶有Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切位點的互補(bǔ)雙鏈DNA，序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，一條為 AAT TCCACCTTGTCCTCACGGTCCAGTTTTCCCAGGAATC CCTTAGATGCTAAGATGGGGATTCCTGGAAATACTG TTCTTGAGGTCATGGTTA，另一條為AGCTTAACCAT GACCTCAAGAACAGTATTTCCAGGAATCCCCATCTT AGCATCTAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACCGTGA GGACAAGGTGG。Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pcDNATM6.2-GW，用T4DNA連接酶連接線性化質(zhì)粒載體與目的基因退火片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，挑取單個克隆后采用含壯觀霉素的LB培養(yǎng)基篩選擴(kuò)增，12-16 h后提取質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司對重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW-premiR-145進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)驗證 miR-145在Tca-8113細(xì)胞中的表達(dá) 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145轉(zhuǎn)染 Tca-8113細(xì)胞，然后采用qRT-PCR檢測成熟miR-145的表達(dá)水平。實驗分組:miR-145組為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145;control組為未作處理的Tca-8113細(xì)胞;miR－145的逆轉(zhuǎn)錄引物序列GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG GATACGACAGGGATT，上游引物為:5’－CAGTGCGTGTCGTGGAGT－3’，下游引物為:5’－AGGTCCAGTTTTCCCAGG－3’，U6作為內(nèi)參。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行擴(kuò)增，條件:95℃，1 min預(yù)變性，95℃變性10 s，60℃退火，延伸40 s，重復(fù)40個循環(huán)，采用2－ΔΔCt計算miR-145表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測miR-145對Tca-8113細(xì)胞增殖的影響 Tca-8113細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。96孔板每孔約3 000個細(xì)胞，采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分組:miR-145組為轉(zhuǎn)染pcDNATM 6.2-GW-pre-miR-145重組質(zhì)粒;Neg-miR-145組為轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW空質(zhì)粒;各組設(shè)3個復(fù)孔，于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h后加入20μl，37℃孵育4 h后棄上清，加入150μl后于492 nm波長下檢測Tca-8113細(xì)胞的吸光度值。

1.2.4 熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建與鑒定 采用targetscan(http://www.targetscan.org/)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則選取miR-145的候選靶基因CDK6，分別于CCAATAATCCTTTGGAAACTGGATC及其互補(bǔ)鏈TCGAGATCCAGTTTCCAAAGGATTATTGGAGCT兩側(cè)添加SacⅠ和XhoⅠ雙酶切位點，命名為野生型CDK6(WT-CDK6)，同時在種子區(qū)設(shè)計突變型CDK6(MT-CDK6)，堿基序列由公司加工合成，并采用Annealing Buffer退火為雙鏈，并連接于pmirGLO真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化與測序方法和miR-145相一致。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-145對CDK6的靶向作用 收集對數(shù)期的Tca-8113細(xì)胞，鋪于96孔板，每孔約4×103個細(xì)胞，設(shè)4組、每組設(shè)3個復(fù)孔，24 h后分別轉(zhuǎn)染Neg-miR(pcDNATM6.2-GW空質(zhì)粒)+WT-CDK6，Neg-miR+MT-CDK6，miR-145+WT-CDK6，miR-145+MT-CDK6。24h后，根據(jù)Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書添加螢火蟲和海腎熒光素酶試劑上機(jī)檢測。

1.2.6 Western blot檢測 miR-145 對 CDK6 蛋白表達(dá)的調(diào)控 實驗分組同MTT，轉(zhuǎn)染24 h后胰酶消化細(xì)胞后采用PBS洗2遍后收集Tca-8113細(xì)胞，采用RIPA裂解液按照操作說明提取蛋白，配置10%的SDS-PAGE凝膠，每孔20μg蛋白量上樣、電泳，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(CDK6 1∶100;β-actin 1∶3 000)4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光觀察蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗進(jìn)行分析，P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR-145表達(dá)載體

Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pcDNATM6.2-GW與退火成雙鏈的pre-miR-145相連接后，將重組的miR-145真核表達(dá)載體進(jìn)行測序，結(jié)果表明重組的pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145真核表達(dá)載體無堿基序列的突變與丟失。采用qRT-PCR檢測miR-145在miR-145組與control組中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-145組中miR-145的表達(dá)顯著高于內(nèi)源性表達(dá)量(P＜0.001，見圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測miR-145在miR-145組與control組中的表達(dá)Figure 1 The expression of miR-145 in miR－145 group and control group using qRT-PCR

2.2 miR-145能夠抑制Tca-8113細(xì)胞的增殖

將 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145 和 pcDNATM 6.2-GW空載體分別轉(zhuǎn)染口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞;如圖2所示，轉(zhuǎn)染miR-145的 Tca-8113細(xì)胞的增殖活性明顯低于空載體組(P＜0.01)，表明miR-145能夠明顯抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞的增殖。

2.3 miR-145能夠靶向下調(diào)CDK6的表達(dá)

通過Targetscan預(yù)測miR-145與CDK6間存在良好的堿基互補(bǔ)配對，在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建CDK6野生型(WT-CDK6)及突變型(MT-CDK6)真核表達(dá)載體(圖3)，與miR-145和Neg-miR共轉(zhuǎn)染Tca-8113細(xì)胞。雙熒光素酶報告基因檢測顯示共同轉(zhuǎn)染miR-145+WT-CDK6后，熒光素酶活性表達(dá)明顯受到抑制，而轉(zhuǎn)染 Neg-miR+WT-CDK6，Neg-miR+MT-CDK6，miR-145+MT-CDK6組的熒光素酶活性無明顯變化。結(jié)果表明，miR-145與CDK6之間存在良好的靶向關(guān)系(P=0.002，見圖4)。

圖2 MTT法檢測Neg-miR組與miR-145組的細(xì)胞增殖情況Figure 2 Cell proliferation in Neg-miR group and miR-145 group by MTT

圖3 Targetscan預(yù)測miR-145與CDK6堿基互補(bǔ)情況及突變位點Figure 3 Predicted miR-145 and CDK6 complementary base and mutations in Targetscan

圖4 雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果Figure 4 Dual-Luciferase reporter assay results

2.4 miR-145能夠抑制內(nèi)源性CDK6蛋白的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pcDNATM 6.2-GW-pre-miR-145的Tca-8113細(xì)胞其下游CDK6的蛋白表達(dá)水平顯著低于轉(zhuǎn)染pcDNATM 6.2-GW空載體的 Tca-8113細(xì)胞，表明miR-145能夠抑制Tca-8113細(xì)胞中CDK6的蛋白表達(dá)水平(見圖5)。

圖5 Western blot檢測miR-145對CDK6蛋白表達(dá)的調(diào)控Figure 5 The regulation of miR-145 to CDK6 protein expression by Western blot

3 討論

2003年世界口腔健康統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示口腔鱗狀細(xì)胞癌占口腔惡性腫瘤的90%以上，口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率在26種主要惡性癌癥中位居第八位，盡管隨著手術(shù)技術(shù)和基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，包括手術(shù)為主，放療和化療在內(nèi)的綜合治療，使其5年死亡率已經(jīng)明顯下降，但是仍然是癌癥死亡的主要疾病之一。因此，尋找新的生物標(biāo)志物和探索新的治療靶點，對口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療具有重要意義。

近年來，microRNA是一個研究熱點，其廣泛存在于生物體內(nèi)，是一類長度在19-25 bp、高度保守的非編碼小RNA，是具有莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈RNA分子。miRNA以序列特異性的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在動植物發(fā)育、細(xì)胞凋亡、代謝以及疾病發(fā)生等方面都起著重要作用，從而受到廣泛關(guān)注。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)microRNA只有人類基因總數(shù)的2%，卻調(diào)節(jié)著人類全基因組中30%以上的基因表達(dá)［11］，因此，其可以成為一個比較穩(wěn)定的抗癌靶點。

Kozaki等［12］檢測了 148 個 miRNAs在 18 個口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有54個miRNAs表達(dá)下調(diào)，11個miRNAs表達(dá)上調(diào)。原癌基因miRNAs常在腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展;相反，抑癌基因miRNAs常表達(dá)下調(diào)，減少或消除對腫瘤發(fā)展的抑制作用。miR-145定位于染色體5q32-33，被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中低表達(dá)，如直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、胰腺癌、尤文氏肉瘤等，且通過作用于多個靶基因來抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮類似于抑癌基因的作用。如Chiyomaru等［13］研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中miR-145可以作為抑癌基因下調(diào)FSCN1的mRNA和蛋白表達(dá)。Wang等［14］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)的miR-145可以抑制RTKN蛋白表達(dá)以及其mRNA水平，并且miR-145過表達(dá)質(zhì)?？梢砸种芃CF-7細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡。miR-145能抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，促使細(xì)胞周期阻滯并抑制其侵襲轉(zhuǎn)移，起到抑癌基因的作用。但是miR-145在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的相關(guān)研究目前報道較少。

為了研究miR-145在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，本研究通過構(gòu)建miR-145真核表達(dá)載體，將構(gòu)建成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Tca-8113細(xì)胞系，并采用熒光實時定量PCR檢測miR-145的含量，結(jié)果顯示miR-145組中miR-145的表達(dá)顯著高于未作處理的Tca-8113組。為了進(jìn)一步研究miR-145的過表達(dá)對Tca-8113細(xì)胞增殖活性的影響，我們采用MTT法進(jìn)行了檢測，將 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145和pcDNATM6.2-GW空載體分別轉(zhuǎn)染口腔鱗狀細(xì)胞癌 Tca-8113，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 miR-145的 Tca-8113細(xì)胞的增殖活性明顯低于空載體組(P＜0.01)，表明miR-145能夠抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞的增殖。

我們對miR-145抑制Tca-8113細(xì)胞增殖的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，生物信息學(xué)軟件是預(yù)測miRNAs靶基因的重要方法之一。目前被證實的miRNA靶基因均是以生物信息學(xué)的預(yù)測為基礎(chǔ)的。首先，通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測miR-145可能作用的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDK6可能是miR－145的候選靶基因。為了對其進(jìn)行驗證，本研究采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗證，結(jié)果表明共同轉(zhuǎn)染miR-145和WT-CDK6后，熒光素酶活性表達(dá)明顯受到抑制，說明miR-145能夠?qū)ca-8113細(xì)胞中的CDK6基因起到抑制性的調(diào)控作用。Western blot結(jié)果表明miR-145能夠抑制Tca-8113細(xì)胞中CDK6的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證了二者之間的靶向關(guān)系。

綜上所述，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，miR-145的過表達(dá)可以顯著抑制Tca-8113細(xì)胞的增殖活性，同時可以靶向CDK6引起其蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，而CDK6作為一個周期蛋白，又與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，因此，本研究初步推測miR-145可能通過靶向CDK6引起口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞的增殖活性，這也為我們后期進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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