孫玉生， 林 波， 王思謙， 劉 悅， 張優(yōu)敬， 鄭乃芮， 皇甫超申△

(河南大學(xué)1護(hù)理學(xué)院，2醫(yī)學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，河南開(kāi)封475004)

隨著酗酒人群的增加，慢性酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)發(fā)病率逐年上升。ALD可表現(xiàn)為酒精性肝炎，酒精性肝脂肪變，酒精性肝纖維化(alcoholic hepatic fibrosis，AHF)和酒精性肝硬化。肝纖維化是肝臟損傷后進(jìn)行纖維化修復(fù)的一個(gè)過(guò)程，啟動(dòng)這個(gè)過(guò)程的是酒精性肝損傷時(shí)產(chǎn)生的過(guò)氧化物質(zhì)及激活的庫(kù)夫氏細(xì)胞、浸潤(rùn)的白細(xì)胞，甚至有損傷的肝細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，尤其是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等?；钚匝趸蚣?xì)胞因子激活靜止的肝星狀細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)化為活化的肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量膠原纖維，分割肝小葉，造成假小葉，最終導(dǎo)致肝硬化。肝纖維化進(jìn)程能否被逆轉(zhuǎn)是治療和預(yù)防肝纖維化的關(guān)鍵。中藥預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的實(shí)踐已經(jīng)提示我們肝纖維化是可以部分逆轉(zhuǎn)的［1］，但是其具體機(jī)制尚不清楚。

最近發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞通過(guò)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)產(chǎn)生膠原纖維參與肝纖維化進(jìn)程［2］。在體外用 TGF-β1可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生EMT［3］，在人肝纖維化活檢標(biāo)本內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象［4］。但是，在用四氯化碳急性肝毒性誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠模型上出現(xiàn)了兩種截然相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:同樣是用世系追蹤技術(shù)，將肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入標(biāo)簽基因，Taura等［5］發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)白蛋白不能與間充質(zhì)標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP-1)共定位，認(rèn)為肝細(xì)胞不可能發(fā)生EMT;Zeisberg等［6］發(fā)現(xiàn)肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞內(nèi)白蛋白與間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和FSP-1共定位，肝細(xì)胞發(fā)生了EMT。目前對(duì)肝細(xì)胞是否通過(guò)EMT參與肝纖維化過(guò)程仍存在很大爭(zhēng)議［7］。然而，搞清楚肝纖維化進(jìn)程中肝內(nèi)上皮細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生EMT，是否通過(guò)EMT參與肝纖維化對(duì)預(yù)防和治療肝纖維化非常重要。因?yàn)镋MT是一個(gè)可逆的過(guò)程，在一定條件下會(huì)發(fā)生間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition，MET)。人肝纖維化活檢標(biāo)本不同于小鼠四氯化碳攝入后的肝纖維化標(biāo)本，毒物攝入的劑量和時(shí)間、選取標(biāo)本的時(shí)機(jī)、觀察指標(biāo)都是引起目前關(guān)于肝細(xì)胞是否通過(guò)EMT參與肝纖維化爭(zhēng)議的原因。為了更好地模擬臨床肝纖維化進(jìn)程，本課題單純用慢性酒精攝入誘導(dǎo)肝纖維化，通過(guò)對(duì)肝損傷和纖維化修復(fù)指標(biāo)進(jìn)行觀察，分析肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞是否發(fā)生了EMT及其對(duì)肝纖維化的影響。

材料和方法

1 試劑和主要儀器

無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市晨?；瘜W(xué)試劑廠(分析純);可見(jiàn)光法丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;SP免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)于福州邁新生物試劑公司;羊抗鼠白蛋白、E-鈣黏素、α-SMA 和 TGF-β1單克隆抗體購(gòu)自NeoMarkers;抗S100A4(FSP-1)抗體購(gòu)自Abcam;FITC和Texas Red熒光標(biāo)記Ⅱ抗、兔抗鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)抗體、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及β-actin抗體購(gòu)自碧云天。病理形態(tài)觀察用 BX51熒光顯微鏡(Olympus)，電荷耦合器(charge-coupled device，CCD)拍照，免疫熒光共定位采用激光共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus)，選用×60油鏡進(jìn)行觀察和圖像采集;蛋白質(zhì)定量用UV-540紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UNICAM)。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移用DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)完成。用WD-9413B凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡條帶吸光度。

2 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組實(shí)驗(yàn)

5～6周齡健康 C57BL/6雄性小鼠30只(合格證號(hào)為SCXK京2006-0009)，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠各組單籠飼養(yǎng)，室溫控制在 20～25℃，相對(duì)濕度 60% ～70%，定期更換墊料消毒。采光控制為8 h光照，16 h黑暗(5:00 PM～9:00 AM)。自由進(jìn)食水，食物為河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用水選用實(shí)驗(yàn)室自制單蒸水。隨機(jī)分為3組，每組10只:(1)對(duì)照組用蒸餾水代替酒精灌胃 (20 mL·kg-1·d-1);(2)低劑量酒精組，每天灌胃酒精量2.0 g·kg-1·d-1;(3)高劑量酒精組每天灌胃酒精量4.0 g·kg-1·d-1。所有動(dòng)物在第5個(gè)月末被處死。計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量/小鼠體重×100%。取血和肝組織進(jìn)行生化和病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

3 肝臟病理組織學(xué)檢查

取每只小鼠肝左葉相同部位的一小塊肝組織，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色光鏡下觀察一般形態(tài);Masson染色觀察膠原纖維。HE染色肝組織炎癥活動(dòng)程度用Scheuer評(píng)分，Massion膠原纖維染色纖維化程度用Schmid M評(píng)分。

4 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL法檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞凋亡，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照用PBS代替TdT酶反應(yīng)液，其余步驟相同。以平均每100個(gè)肝組織細(xì)胞核中TUNEL熒光標(biāo)記呈凋亡特征的細(xì)胞核個(gè)數(shù)作為肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)。

5 肝生化指標(biāo)及氧化指標(biāo)的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠麻醉后，摘眼球取血，3 500×g離心10 min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)的活性。每例均切取肝右葉相同部位一小塊新鮮肝組織，以4℃ 生理鹽水制成10% 組織勻漿，3 500×g離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定組織CAT、SOD的活性及和MDA的含量。另外留取一部分新鮮肝組織用于Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)。

6 免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá)

所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為6 μm。切片脫蠟水化，檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，加入Ⅰ抗，4℃冷藏2 h，室溫放置30 min，PBS緩沖液沖洗后加入熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育15 min，PBS緩沖液洗片，DAPI核復(fù)染。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。E-鈣黏素分布于肝細(xì)胞膜上、白蛋白位于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈綠色熒光;α-SMA和FSP-1蛋白位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈紅色熒光。白蛋白和FSP-1共定位的細(xì)胞呈橙色。

7 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

新鮮肝組織低溫勻漿后，用RIPA 200 μL充分裂解提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)樣品蛋白濃度，均衡每組蛋白濃度后，以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加入Ⅰ抗(1∶200)于4℃封閉袋中孵育過(guò)夜，Ⅱ抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，1∶4 000)孵育1 h。化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光。凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡條帶。先計(jì)算各蛋白表達(dá)吸光度與β-actin吸光度的比值，然后將對(duì)照組的蛋白吸光度比值設(shè)定為1，得出各處理組與對(duì)照組蛋白表達(dá)相對(duì)吸光度值。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 12.0軟件包處理，經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素方差分析比較各處理組間差別，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟指數(shù)和血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低劑量酒精組小鼠肝臟指數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變;高劑量酒精組肝臟指數(shù)與對(duì)照組比較明顯升高(P＜0.05)。各酒精組小鼠血清ALT和AST活性比對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性的影響Table 1.Effects of chronic alcohol intake on liver index，and serum ALT and AST levels in mice(Mean±SD.n=10)

2 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟病理形態(tài)的影響

Figure 1.Chronic alcohol intake induced liver injury and fibrosis in C57BL/6J mice.C57BL/6J mice were fed with water or alcohol by gavage for 5 months，and the histological analysis of the liver was performed.The first column，representative images of HE staining，showed that liver fatty degeneration induced by alcohol administration was enhanced in low-dose alcohol-treated mice.The second column，TUNEL assay of liver sections，showed that the high-dose alcohol-treated mice displayed an increase in TUNEL-positive cells(marked by arrows).The third column，hepatic tissue sections with Masson′s trichrome staining，showed periportal fibrosis with short septa extending into lobules in low-dose alcohol-treated mice or porto-portal septa in high-dose alcohol-treated mice，suggesting that hepatic fibrosis was significantly worsened in the high-dose alcohol-treated mice as compared with the low-dose alcohol-treated mice.圖1 慢性酒精攝入導(dǎo)致小鼠肝損傷和纖維化

對(duì)照組肝臟呈暗紅色，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝組織內(nèi)個(gè)別細(xì)胞凋亡，肝纖維化程度Schmid M評(píng)分為0。和對(duì)照組相比，低劑量酒精組肝體積略大，顏色稍黃，質(zhì)地稍硬，切面未見(jiàn)明顯結(jié)節(jié);光鏡下HE染色可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)密布大小不一的脂肪空泡，尤其是中央靜脈周?chē)渭?xì)胞內(nèi)脂肪空泡最多，炎癥活動(dòng)度Scheuer評(píng)分明顯高于對(duì)照組;TUNEL熒光標(biāo)記陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞也主要分布于中央靜脈周?chē)谓M織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高;Masson三染色結(jié)果顯示，從匯管區(qū)至中央靜脈有纖維組織條帶，條帶周?chē)渭?xì)胞內(nèi)呈藍(lán)色，肝纖維化程度Schmid M評(píng)分也升高。高劑量酒精組肝臟體積縮小，質(zhì)地硬，呈褐色，切面可見(jiàn)彌漫性的小結(jié)節(jié);HE染色未見(jiàn)明顯的脂肪空泡，匯管區(qū)周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)界板肝細(xì)胞碎片壞死，炎癥活動(dòng)度Scheuer評(píng)分高于對(duì)照組和低劑量酒精組;TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞增多且分布于肝小葉內(nèi)，肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)高于對(duì)照組和低劑量酒精組;Masson三染色可見(jiàn)纖維組織呈條帶狀分割肝小葉，形成假小葉，纖維條帶內(nèi)和周?chē)懿夹切渭?xì)胞和炎癥細(xì)胞，肝纖維化程度Schmid M評(píng)分同樣高于對(duì)照組和低劑量酒精組，見(jiàn)圖1、表2。

表2 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟炎癥評(píng)分、細(xì)胞凋亡和纖維化程度的影響Table 2.Effects of chronic alcohol intake on the inflammation，apoptosis and fibrosis in the liver of mice(Mean±SD.n=10)

3 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟氧化和抗氧化指標(biāo)的影響

第5個(gè)月末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，無(wú)論低劑量酒精組還是高劑量酒精組小鼠肝臟MDA與對(duì)照組相比均明顯升高(P＜0.05)，而高、低劑量組之間則無(wú)顯著差別;各酒精組小鼠肝組織SOD和CAT活性比對(duì)照組明顯下降(P＜0.05)，高、低劑量組之間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

4 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

Figure 2.Effect of chronic alcohol intake on hepatocyte epithelial-mesenchymal transition in livers of C57BL/6J mice.The mice were given(ig)alcohol for 5 months.The first and second columns showed the representative images of E-cadherin(green)and α-SMA(red)immunofluorescence examination.The third column showed hepatic tissue sections counterstained with DAPI(blue).The alcohol treatment significantly decreased E-cadherin expression compared with control mice，while α-SMA protein expression was significantly increased in the alcohol-treated mice.圖2 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

表3 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝組織SOD、CAT活性和MDA含量的影響Table 3.Effects of chronic alcohol intake on the activity of SOD and CAT，and the content of MDA in the liver of mice(Mean±SD.n=10)

肝臟上皮標(biāo)志物E-鈣黏素(綠色)和間充質(zhì)活化的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA(紅色)免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示:對(duì)照組E-鈣黏素均勻連續(xù)分布于肝細(xì)胞膜上，呈連續(xù)綠色熒光;匯管區(qū)周?chē)猩倭啃〖?xì)胞表達(dá)α-SMA蛋白，并未見(jiàn)肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞表達(dá)α-SMA。低劑量酒精組中央靜脈周?chē)渭?xì)胞膜上連續(xù)綠色熒光減弱，提示細(xì)胞膜上E-鈣黏素表達(dá)減少;而位于匯管區(qū)周邊的肝小葉內(nèi)α-SMA蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增加。高劑量酒精組肝細(xì)胞膜上連續(xù)綠色熒光減弱更明顯，提示肝細(xì)胞膜上E-鈣黏素表達(dá)下降更明顯;可見(jiàn)匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)α-SMA蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增多較低劑量酒精組明顯增加，見(jiàn)圖2。

5 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟白蛋白和FSP-1蛋白表達(dá)的影響

圖3顯示的是用白蛋白(綠色熒光)和FSP-1蛋白(紅色熒光)雙標(biāo)記的激光共聚焦圖片。對(duì)照組肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)白蛋白豐富，未顯示紅色熒光，肝內(nèi)個(gè)別成纖維細(xì)胞呈紅色熒光，散落于肝細(xì)胞之間，未與肝細(xì)胞共定位。在低劑量酒精組可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)綠色熒光和紅色熒光共定位，這意味著肝細(xì)胞內(nèi)存在FSP-1蛋白，也就是說(shuō)肝細(xì)胞獲得了一定的間充質(zhì)成纖維細(xì)胞表型，呈現(xiàn)不完全EMT現(xiàn)象。高劑量酒精組肝細(xì)胞內(nèi)白蛋白明顯減少，綠色熒光和紅色熒光共定位的現(xiàn)象少見(jiàn)，而完全呈現(xiàn)紅色熒光的肝細(xì)胞明顯比低劑量酒精組增加，說(shuō)明這些肝細(xì)胞發(fā)生了完全EMT。

Figure 3.Chronic alcohol intake stimulated hepatocyte epithelial-mesenchymal transition in livers of C57BL/6J mice.The mice were given(ig)alcohol for 5 months，and the expression of albumin and fibroblast-specific protein 1(FSP-1)in liver tissues was analyzed by immunofluorescent confocal microscopy.The first and second columns showed the representative images of albumin(green)and FSP-1(red)immunofluorescence examination in control mice and the mice with low-dose and high-dose alcohol treatment.The third column showed the merged images.Representative cells at the same position were marked by arrows.FSP-1 immunostaining(red)and albumn immunostaining(green)overlapped and seem to be co-localized in the hepatocytes of low-dose alcohol group;only FSP-1 positive hepatocytes with negative staining for albumin were showed in high-dose alcohol group.圖3 慢性酒精攝入刺激小鼠肝細(xì)胞發(fā)生上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

6 慢性酒精攝入對(duì)小鼠肝臟EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各組酒精攝入的小鼠肝組織內(nèi)E-鈣黏素表達(dá)減少，α-SMA、FSP-1、TGF-β1和 HIF-1α 蛋白表達(dá)均升高;與低劑量酒精組相比，高劑量組E-鈣黏素表達(dá)更少，α-SMA、FSP-1和 TGF-β1蛋白表達(dá)均升高更明顯，而HIF-1α蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Effects of chronic alcohol intake on expression of E-cadherin ，α-SMA，F(xiàn)SP-1，TGF-β1and HIF-1α in livers of C57BL/6J mice detected by Western blotting analysis.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs alcohol(2.0 g·kg-1)group.圖4 慢性酒精攝入對(duì)C57BL/6J小鼠肝E-鈣黏素、α-SMA、FSP-1、TGF-β1和HIF-1α表達(dá)的影響

討 論

酒精通過(guò)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素P4502E1和酒精脫氫酶系統(tǒng)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，酒精代謝產(chǎn)物乙醛也發(fā)揮氧化應(yīng)激作用，從而使肝細(xì)胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶釋放入血，致使血清ALT和AST水平升高［8］。活性氧和炎癥細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子造成肝細(xì)胞持續(xù)損傷，肝細(xì)胞內(nèi)一些活性因子也釋放到細(xì)胞外，激活肝內(nèi)庫(kù)夫氏細(xì)胞。酒精持續(xù)攝入導(dǎo)致這些炎癥細(xì)胞和受損的肝細(xì)胞不斷釋放TGF-β1、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等促炎癥因子，這些促炎因子連同活性氧、乙醛等有害物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞造成持續(xù)損害。這樣肝臟利用肝細(xì)胞再生對(duì)受損的肝臟進(jìn)行完全修復(fù)幾乎不可能完成，而纖維性修復(fù)就成了慢性酒精性肝病進(jìn)行修復(fù)的主要形式，導(dǎo)致的后果是肝纖維化進(jìn)展和肝硬化形成。參與肝纖維化進(jìn)展的主要是激活的肌成纖維細(xì)胞合成分泌的膠原蛋白。肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源是肝內(nèi)增殖與活化的星形細(xì)胞。正常情況下，肝內(nèi)只有少量的星形細(xì)胞，體積較小，位于內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間的間隙內(nèi)，當(dāng)肝臟持續(xù)嚴(yán)重受損時(shí)，大量細(xì)胞致炎因子被釋放，激活星形細(xì)胞使之增殖并轉(zhuǎn)化為活化的肌成纖維細(xì)胞［9］。肌成纖維細(xì)胞分泌膠原組成的膠原纖維雜亂無(wú)章，與匯管區(qū)增生的纖維相互交織，分割肝小葉，形成假小葉，最終演變?yōu)楦斡不?。本?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的低劑量酒精攝入，肝組織氧化指標(biāo)MDA增加，抗氧化指標(biāo)SOD和CAT活性下降，肝細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，造成肝細(xì)胞損傷和脂肪變性，少量肝細(xì)胞凋亡和輕度肝纖維化;高劑量酒精攝入，肝組織氧化指標(biāo)MDA增加，抗氧化指標(biāo)SOD和CAT活性下降更加明顯，嚴(yán)重的過(guò)氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和凋亡增加，從而引起大量膠原纖維增生和假小葉形成。這些結(jié)果表明，肝纖維化的程度取決于肝氧化損傷的程度，也可以說(shuō)取決于酒精攝入的劑量。

E-鈣黏素分布于肝細(xì)胞膜上，是肝細(xì)胞間相互連接的主要物質(zhì)，肝細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜上E-鈣黏素減少，相鄰肝細(xì)胞間隙擴(kuò)大，這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加［10］。肝細(xì)胞為了適應(yīng)氧化應(yīng)激和有害細(xì)胞因子增多的環(huán)境，往往會(huì)通過(guò)EMT的方式發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，只有轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞表型，才能更好地耐受細(xì)胞凋亡［11］。EMT是指上皮細(xì)胞失去彼此黏附，獲得運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞表型。通常將EMT分為3型:1型是指胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)生的EMT，2型指組織損傷修復(fù)時(shí)發(fā)生的EMT，3型是癌侵襲轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)生的EMT。這3種EMT之中只有2型EMT可產(chǎn)生膠原纖維，參與器官纖維化形成［12］。腎小管上皮細(xì)胞通過(guò)EMT產(chǎn)生膠原參與腎纖維化已經(jīng)得到證實(shí)［13］，但是肝細(xì)胞通過(guò)EMT是否參與纖維化目前還存在爭(zhēng)議。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒精攝入導(dǎo)致肝細(xì)胞E-鈣黏素表達(dá)下降，間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和FSP-1表達(dá)增多，提示肝細(xì)胞發(fā)生了EMT。因?yàn)棣?SMA是激活的肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，正常情況下存在于肝小葉匯管區(qū)血管周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)。如果肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)α-SMA陽(yáng)性顆粒，意味著肝細(xì)胞有可能轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的表型。為了進(jìn)一步驗(yàn)證酒精攝入是否真的導(dǎo)致了肝細(xì)胞發(fā)生EMT，本實(shí)驗(yàn)選用成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物FSP-1蛋白和肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物白蛋白進(jìn)行免疫熒光共定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量酒精組肝細(xì)胞出現(xiàn)了FSP-1和白蛋白共定位，而高劑量酒精組，F(xiàn)SP-1只出現(xiàn)在幾乎無(wú)白蛋白表達(dá)的肝細(xì)胞內(nèi)。因?yàn)镕SP-1是來(lái)自于EMT演變的成熟肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，正常的肝星形細(xì)胞和產(chǎn)生1型膠原的肌成纖維細(xì)胞(α-SMA陽(yáng)性)都不表達(dá) FSP-1［14］。所以這些結(jié)果表明，低劑量酒精組肝細(xì)胞發(fā)生了不完全EMT，高劑量酒精組肝細(xì)胞發(fā)生完全EMT，參與肝纖維化進(jìn)程。

慢性酒精性肝損傷時(shí)肝細(xì)胞發(fā)生EMT的原因可能與下列因素有關(guān):(1)TGF-β1大量升高，而TGF-β1既可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，也可誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT［15］;(2)酒精攝入造成肝內(nèi)活性氧大量增加，而活性氧可誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT［16］;(3)肝細(xì)胞脂肪變和水樣變性，纖維組織增生，導(dǎo)致肝血竇變窄，肝臟淤血，肝細(xì)胞缺氧，由此導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)HIF-1α累積，而HIF-1α可直接導(dǎo)致肝細(xì)胞 EMT［17］。

盡管肝細(xì)胞通過(guò)EMT參與肝纖維化的程度和機(jī)制都不很清楚，但是通過(guò)設(shè)計(jì)藥物，阻斷引起EMT的信號(hào)通路，從而拮抗肝纖維化，將成為預(yù)防和治療肝硬化的又一措施。

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