李福生， 肖明明， 徐紹年， 杜振廣， 王 亮， 黃 海， 景士兵

實驗研究

HER-2在惡性黑色素瘤中的蛋白表達、基因擴增及其臨床意義

李福生， 肖明明， 徐紹年， 杜振廣， 王 亮， 黃 海， 景士兵

目的檢測惡性黑色素瘤中HER2的蛋白表達、基因擴增情況，并探討其臨床意義。方法以石蠟包埋組織芯片為材料,分別采用免疫組織化學PV9000二步法與熒光原位雜交技術檢測HER2蛋白在惡性黑色素瘤、色素痣中的表達及基因擴增。結果HER2蛋白在惡性黑色素瘤、色素痣中的表達陽性率分別為76.9%、25.0%，擴增陽性率分別為75.0%、30.0%；兩者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=12.480,P=0)；在惡性黑色素瘤中HER2蛋白表達、基因擴增陽性率與浸潤深度及淋巴結轉移有關(P<0.05)。結論HER2與惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，可以將其作為判斷惡性黑色素瘤生物學行為的重要參考指標。

惡性黑色素瘤； HER2； 免疫組織化學; 熒光

惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是起源于神經嵴黑色素細胞的高度惡性腫瘤,其侵襲力強、轉移性高、發(fā)展迅速且預后極差。其發(fā)生發(fā)展是多種因素、多個步驟及階段共同作用的過程[1]。自2013年11月至2014年7月，我們采用組織芯片免疫組化方法及免疫熒光原位雜交方法檢測HER-2在惡性黑色素瘤和色素痣組織中的蛋白表達及基因擴增情況。

1 標本來源

收集2008年1月至2014年6月本科室存檔的MM蠟塊52例，色素痣20例。52例MM樣本中，男性24例，女性28例；年齡22～76歲，平均(56.8±11.2)歲。有淋巴結轉移者24例，無淋巴結轉移者28例；根據腫瘤細胞浸潤深度(Clark分級)：Ⅰ級(表皮及附屬器上皮)14例，Ⅱ、Ⅲ級(真皮乳頭層)14例，Ⅳ級(真皮網狀層)9例，Ⅴ級(侵及皮下組織)15例。所有患者術前均未接受放、化療或免疫制劑。

2 實驗方法

將蠟塊切取1張5 μm切片，經HE染色后，在蠟塊上選取相應區(qū)域，采用手工組織芯片制備儀(上海博南生物技術有限公司)制備直徑為2 mm的組織芯片，從芯片蠟塊上切取3張5 μm切片，分別進行HE染色、熒光原位雜交及免疫組織化學PV 9000二步法分析。

2.1 組織芯片蠟塊制備 將受體蠟塊放在37 ℃恒溫臺上，軟化5 min；固定蠟塊，利用2 mm點樣針在受體蠟塊上打孔，針點間隔1 mm。受體蠟塊按9×5陣列打孔；打孔完成后，放于取樣平臺，將供體蠟塊也放在取樣平臺上，使用點樣針在預先做好取樣標記的供體蠟塊上取樣，將點樣針取出的樣本填入受體蠟塊的蠟孔中，組織芯片蠟塊面朝下放在一玻片上輕拍，使組織芯片蠟塊表面整齊；將組織芯片蠟塊放在65 ℃烤箱中30 min，使其完全熔合；將自然冷卻的組織芯片蠟塊放在冷凍臺上5 min，制備完畢(圖1)。

2.2 免疫組織化學PV9000二步法 組織芯片蠟塊切片脫蠟至水；蒸餾水沖洗， PBS浸泡5 min；3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS液沖洗2 min，3次；滴加稀釋的HER2抗體(1∶100)，37 ℃孵育2 h；PBS液沖洗2 min，3次；滴加二氨基聯(lián)苯胺底物濃縮液,37 ℃孵育20 min，PBS液沖洗2 min，3次；滴加二氨基聯(lián)苯胺底物緩沖液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次2 min；顯色劑顯色；自來水充分沖洗，復染，脫水透明，封片。用PBS代替HER-2抗體作為陰性對照，陽性對照為已知的HER-2陽性乳腺癌組織切片。

2.3 熒光原位雜交法 組織切片在65 ℃下烘烤3 min。將組織切片浸于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10 min，隨后浸入100%乙醇中5 min；室溫下，將組織切片依次置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各2 min復水。組織切片室溫浸入去離子水中3 min，用無絨紙巾吸取多余的水分，100 ℃沸水煮玻片20 min，再置于濃度100 μg/ml蛋白酶K中消化；將組織切片置于核酸雜交漂洗液中漂洗2次，每次5 min。1%甲醛室溫固定10 min。玻片依次置于-20 ℃預冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脫水；將組織切片室溫浸入丙酮溶液中2 min。自然干燥玻片。加熱玻片至56℃，將10 μl探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封片，準備雜交儀器，共變性條件：83 ℃ 5 min，42 ℃ 16 h，玻片洗滌：0.3%乙基苯基聚乙二醇 65 ℃沖洗1.5 min, 0.1%乙基苯基聚乙二醇室溫沖洗30 s,70%乙醇沖洗3 min。暗處自然干燥玻片；室溫中將15 μl 4,6-二氨基-2-苯基吲哚復染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min，在Olympus BX51型熒光顯微鏡下選用合適的濾片組觀察玻片,以>75%的細胞核內≥2個HER 2信號判斷雜交成功。

2.4 結果判定標準 本實驗研究染色結果判斷標準參照陽性細胞半定量分級法。隨機觀察5個高倍鏡下視野,每個視野計數100個細胞。①根據著色的強弱分級,不著色的視野為0分,與背景色一致的視野為1分,呈淺黃色的視野為2分,呈深黃色的視野為3分,呈棕黃色的視野為4分;②根據陽性細胞面積分級,呈陰性的視野為0分,陽性細胞面積/細胞總面積<25%的視野為1分,26%～50%的視野為2分,51%～75%的視野為3分,>75%的視野為4分。兩者定性乘積分表達0、1分為陰性,≥2分為陽性表達。

熒光原位雜交結果判定標準：計數30個細胞，統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=30個細胞核中紅信號總數/30個細胞核中綠信號總數)。Ratio<1.8為陰性結果，提示該樣本無HER-2基因擴增；Ratio>2.2為陽性結果，提示樣本中HER-2基因發(fā)生擴增；Ratio在1.8～2.2，可增加計數細胞至100個,或重做熒光原位雜交實驗來判斷最終結果。

2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行數據處理，采用χ2檢驗比較HER-2蛋白表達及基因擴增的陽性表達率及與MM浸潤深度及淋巴結轉移的關系，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 HER-2在色素痣及MM中蛋白表達及基因擴增情況 免疫組織化學結果顯示，HER-2蛋白表達于細胞膜及細胞漿中。HER-2蛋白表達的陽性率在MM組和黑素痣組中分別為76.9%和25.0%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=16.615，P=0);HER-2基因擴增的陽性率在MM組和黑素痣組中分別為75.0%和30.0%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=12.480，P=0,圖2,3)。

3.2 HER-2蛋白表達及基因擴增與MM臨床病理學特征的關系 在MM中，隨著腫瘤細胞浸潤深度的增加，HER-2蛋白表達的陽性率增強，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=12.532，P=0.006，表1)；基因擴增的陽性率也增強，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=14.547，P=0.002)。HER-2蛋白表達的陽性率在伴有淋巴結和無淋巴結中分別為95.8%和60.7%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.979，P=0.003)；HER-2基因擴增的陽性率在伴有淋巴結和無淋巴結中分別為95.8%和57.1%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.317，P=0.001)。

圖1 組織芯片蠟塊圖2 熒光原位雜交法檢測HER-2基因擴增情況 a.色素痣HER-2基因無擴增 b.MM中HER-2基因擴增圖3 組織芯片免疫組織化學PV9000二步法檢測HER-2蛋白表達情況 a.色素痣HER-2蛋白陰性表達(×400) b.MM中HER-2蛋白陽性表達(×400)

Fig1 Paraffin embedded tissue microarray.Fig2 FISH method for detection of the amplification of HER-2 gene. a. pigmented nevus without HER-2 gene amplification. b. amplification of HER-2 gene in malignant melonoma.Fig3 Tissue chip immunohistochemistry PV9000 two steps method to detect the expression of HER-2 protein. a. the negative of HER-2 protein in pigmented nevus (×400). b. the positive expression of HER-2 protein in malignant melonoma (× 400).

表1 MM中HER-2與臨床病理學特征的關系

Tab1 The relationship between MM in the expression of HER-2 and clinicopathological characteristics

浸潤深度例數HER-2的陽性率蛋白表達基因擴增 Ⅰ級148(57.1%)7(50.0%) Ⅱ、Ⅲ級149(64.3%)9(64.3%) Ⅳ級98(88.9%)8(88.9%) Ⅴ級1515(100.0%)15(100.0%)

4 討論

近年來，分子生物學研究結果表明，腫瘤是一種基因異常變化的疾病。癌基因的激活和抑癌基因的失活在許多腫瘤中起著一定的作用。Her-2基因是癌基因,定位于人染色體17q21，具有酪氨酸激酶活性的細胞膜糖蛋白,屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族。HER-2基因參與細胞的分裂、生長、繁殖的調控,與細胞運動、生長、生存能力的增強及癌細胞轉移有關[2]。正常情況下，HER-2基因處于非激活狀態(tài),當受到某些致癌因素的作用后, 其結構或表達失控而被激活,轉而具有腫瘤轉化活性,促使細胞發(fā)生惡性轉化[3-4]。HER-2的高表達已在多種腫瘤中發(fā)現, 如乳腺癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、骨肉瘤[3-9]。研究表明，30%以上的人類腫瘤組織中，伴有HER-2基因的過度表達，并與腫瘤分化程度、臨床分期呈正相關, 且表達越高, 預后越差。HER-2基因結構的改變，如過度擴增表達促使細胞有絲分裂，在疾病啟動階段后期，這種機制使某些不正常細胞獲得不受機體控制而獨立生長的能力。HER-2的擴增與過量表達也是腫瘤惡變的重要分子事件。本組檢測結果顯示，MM中HER-2蛋白表達與基因擴增明顯高于色素痣。提示惡性黑色素瘤的發(fā)生與HER-2異常表達有關。由此推測，HER-2基因過度表達與MM的發(fā)生發(fā)展密切相關,其在惡性黑色素瘤的侵襲轉移過程中可能起促進作用。

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TheexpressionofHER-2protein,geneamplificationanditsclinicalsignificanceinmalignantmelanoma

LIFu-sheng,XIAOMing-ming,XUShao-nian,etal.

(DepartmentofBoneTumour,ThePeople′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

ObjectiveTo investigate the expression of HER-2 protein and gene amplification in malignant melanoma and evaluation of HER-2 in malignant melanoma occurrence, development and prognosis.MethodsUsing PV-9000 two steps method and in situ chemical hybridization to detect the expression of HER-2 protein, gene amplification in paraffin-embedded tissue chip material.ResultsThe positive rate of HER-2 expression in malignant melanoma, pigmented nevus were 76.9%, 25.0%; The positive rate of HER-2 gene amplification were 75.0%, 30.0%. There were significant differences between malignant melanoma and pigmented nevus in the expression and amplification of HER-2 (χ2=12.480,P=0); The expression and amplification of HER-2 in malignant melanoma had correlation with the depth of invasion and the lymph node metastasis (P<0.05).ConclusionHER-2 is closely related to the occurrence and development of malignant melanoma, and can be considered as an important index for determing the biological behavior of malignant melanoma.

Malignant melanoma； HER-2； Immunohistochemistry; Fluorescence

110016 遼寧 沈陽，遼寧省人民醫(yī)院 骨腫瘤科(李福生，徐紹年，杜振廣，王 亮，黃 海)；遼寧省人民醫(yī)院 病理科(肖明明，景士兵)

李福生(1980-)，男，遼寧遼中人，主治醫(yī)師，碩士研究生.

景士兵，110016，遼寧省人民醫(yī)院 病理科，電子信箱：mypathology@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.11.021

R739.5

A

1673-7040(2014)11-0700-03

2014-10-13)